4.2. CORTE Y UNION DE MOLECULAS DE ADN 4.2.1. ENZIMAS DE CORTE

Enzimas de restricción: producción de fragmentos de DNA para recombinación
Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción fueron descubiertas por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans. Estas son enzimas sumamente específicas que catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en lugares específicos, creando de esta manera una serie de fragmentos. Se ha visto que ciertas cepas de E. coli degradan (cortan) el DNA de ciertos virus fagos infectivos, a menos que los ácidos nucleicos presenten metilación (adición de grupos metilo) en algunos residuos de adenina o citosina del sitio de corte.

La función de las enzimas de restricción es la proteger al organismo de DNA extraño. Cuando una porción de DNA foráneo ingresa a la célula, las enzimas de restricción se encargan de degradarlo cortándolo en pequeños fragmentos, siempre y cuando éste no esté modificado.

Actualmente se conocen unas 200 enzimas de restricción (las más conocidas se muestran en la tabla 1), las cuales se nombran de acuerdo al organismo del cual se extraen, como por ejemplo EcoRI y EcoRII, que se extraen de E. coli o HaeIII que se extrae de Haemophilusaegyptius.

Una característica de las enzimas de restricción es el reconocimiento de secuencias palindromicas.

Tabla. Algunas de las principales enzimas de restricción conocidas y su origen (en base a Griffiths et al. 1998).

Enzima de restricción	Organismo de donde se extrae
EcoRI	Escherichiacoli
EcoRII	Escherichiacoli
HindII	Haemophilusinfluenzae
HindII	Haemophilusinfluenzae
HaeIII	Haemophilusaegyptius
HpaII	Haemophilusparainfluenzae
PstI	Providencia stuartii
Mayi	Serratiamarcesens
BamI	Bacillus amyloliquefaciens
BglII	Bacillusglobiggi

Las enzimas de restricción trabajan únicamente sobre secuencias específicas de bases nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de restricción y producen dos tipos de corte:

(1) corte con extremos cohesivos y

(2) corte con extremos romos (ver Fig. ) (Griffiths et al. 1998).

Los extremos cohesivos dejan porciones lineales a ambos lados del fragmento, es decir, quedan pequeñas secuencias de bases sin aparear a cada lado, siendo éstas complementarias entre sí, mientras que los extremos romos son aquellos en los que no queda una porción lineal a ninguno de los lados.

De acuerdo a la especificidad de las enzimas de restricción, se conocen dos tipos:

1. -las enzimas de tipo I cortan en un sitio cercano al sitio de restricción, a una distancia que varía aleatoriamente, y por ello no se suelen emplear para DNA recombínate.
2. -Las de tipo II reconocen y cortan en la secuencia específica, y son las más empleadas en este tipo de protocolos por su alta precisión.
3. -Las enzimas de restricción de tipo III son similares a las de tipo II en cuanto a la precisión del lugar de corte, pero se diferencian de éstas en que sólo cortan entre nucleótidos del mismo tipo, por ejemplo entre dos adeninas.Algunas enzimas de restricción como EcoRV encuentran el sitio de restricción, por medio de un barrido a lo largo del surco mayor del DNA y reconocen una secuencia palindrómica de seis nucleótidos de longitud, en la que se presenta una simetría rotacional binaria. Cuando la enzima de restricción encuentra el sitio de corte, se producen una serie de reordenamientos estructurales en el DNA y se produce un ajuste inducido en el cual el DNA sufre una torsión de 50 grados. En este proceso se va haciendo un barrido muy rápido sobre la hebra de DNA, leyendo grupos de seis nucleótidos, hasta encontrar la secuencia diana. Esto comprueba el carácter altamente específico de las enzimas de restricción.

Los puntos de corte de las enzimas de restricción pueden ser empleados como marcadores para la elaboración de mapas de restricción. Para elaborar un mapa de restricción, se tiñen los fragmentos resultantes de la lisis y se los separa mediante una electroforesis PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida) y se establecen las distancias de migración, siendo los resultados muy específicos para cada molécula de DNA en estudio.

Los extremos cohesivos son los más empleados en la construcción de DNA recombinante, puesto que al tener una porción lineal "pegajosa" es más sencillo que se produzca la unión con el DNA del hospedero, por complementación de bases, dicha unión se produce por la intervención de enzimas denominadas ligasas. Adicionalmente, la enzima transferasa terminal puede ser usada para generar extremos cohesivos en un fragmento de DNA. A pesar de ser más difícil, también es posible realizar uniones de extremos romos, mediante la adición de conectores sintéticos de DNA que actúan a manera de extremos cohesivos (como el caso de la transferasa terminal), sin embargo este procedimiento no es de mucha utilidad para realizar una clonación directa de DNA.

Existe otro tipo de enzimas de restricción de doble función, denominadas endo–exonucleasas, las cuales son capaces tanto de añadir nucleótidos como de removerlos de una hebra de DNA. Estas enzimas también son muy específicas y reconocen secuencias exactas, plantea que las enzimas de restricción del tipo endo–exonucleasas pueden tener un papel fundamental en la reparación del DNA y/o en la muerte de células defectuosas, gracias a la especificidad de la enzima. Se han hecho numerosos experimentos con endo–exonucleasas aisladas de E. coli, Neurosporacrassa, Aspergillus nidulans, mitocondrias de Saccharomycescerevisiae, Drosophila melanogaster, células de mono y células leucémicas de humano.

 Bibliografía:

Apuntes de clases.