viernes, 7 de diciembre de 2012

5.1.1. SOUTHERN Y 5.1.2. NORTHERN (TAREA)

La hibridación Southern blot (SB)
Necesita de la extracción del ADN de la muestra con fenol/cloroformo y de la eliminación de ARN y proteinas de la misma por digestión enzimática. Con la aplicación de endonucleasas de restricción-la enzima Pst I es la mas utilizada, pues corta los genomas en fragmentos de diferentes tamaños ofreciendo un patrón característico en el gel de agarosa-el ADN se rompe, realizándose una separación electroforética de los fragmentos en gel de agarosa los cuales pueden ser visualizados con bromuro de etidio. El ADN se desnaturaliza y se transfiere a una membrana realizándose una hibridación. El SB es el método de referencia actual de. La especificidad de esta técnica es superior a cualquier otra debido a la purificación extra del ADN por electroforesis. Además es el único método que permite conocer si el genoma viral está en situación episomal o integrado en el ADN celular. Las desventajas fundamentales del SB son su gran complejidad técnica, duración de la misma y la necesidad de utilizar tejidos no fijados, puesto que existen protocolos para material fijado, su sensibilidad se reduce muy notablemente. 

La hibridación Northern 

se utiliza para la detcción de RNA. El ARN celular se extrae y se separa por medio de un gel desnaturalizante que contiene formaldehido. Seguidamente se hibridan con sondas ARN antisense o ADN. 

Northertn Blot: pero permite detectar RNA en vez de DNA (Innis yGelfand, 1990). En síntesis la técnica consiste en extraer el RNA de las células pertinentes y suposterior separación por tamaño mediante electroforesis en gel. Las moléculas de RNA sontransferidas y unidas al filtro, al igual que en el Southern blot. Después de la hibridación con unasonda marcada (y posterior a la detección según el método de marcaje utilizado), las bandas en elgel indican la ubicación de los tipos de RNA que sean complementarios a la sonda. Teniendomarcadores de RNA de tamaño adecuado, se puede conocer el tamaño de los RNA que se hanidentificado. Así, la técnica permite conocer el tamaño preciso de un mRNA, luego del empalmetranscripcional. Además, sirve para identificar diferentes tipos de mRNA codificados por un mismogen y para determinar la cantidad y el tejido específico (o tipo de células) en que se encuentra unmRNA específico. Así, será posible determinar los niveles de actividad génica, por ejemplo durante el desarrollo, o bien en distintos tejidos (o tipos celulares) durante un período definido dela vida, o después de haber sido sometido a los organismos a diferentes estímulos fisiológicos(Russel, 1998).

Es una técnica muy similar al Southern Blot que permite la identificación desecuencias específicas de RNA.La muestra de RNA a analizar no requiere fragmentación y se somete a electroforesis en geles deagarosa, donde las moléculas de RNA se separan desde mayor a menor tamaño.Una vez terminada la electroforesis, y sin teñir el gel, los fragmentos se traspasan a un filtro denitrocelulosa ó a una membrana nylon, luego el filtro se incuba con una sonda marcada, específicapara la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo cDNA, que reconocerá a la secuencia deRNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidosnucleicos.

En todos los sistemas de hibridación descritos anteriormente el ácido nucléico diana está localizado en un soporte sólido, bien una membrana o una biopsia o extendido citológico, en los procedimientos que seguidamente describiremos el ácido nucleico se encuentra disuelto en un líquido. 


Detalle de la tecnica de Southern 

Esta técnica fue descrita por el Dr. Southern en 1975 y constituye el método más utilizado para analizar la estructura del ADN cortado por enzimas de restricción. Para la realización de esta técnica se debe extraer ADN genómico, se pueden extraer de 200 a 300 nanogramos de ADN con lo que se pueden realizar de 20 a 30 "digestiones" con enzimas de restricción. 

Después de dicha digestión, el aproximadamente millón de fragmentos de ADN obtenidos, se separan entre sí, según su tamaño , en un gel de agarosa, sometido a un campo de corriente continua en una cubeta de electroforesis. El ADN posee una carga eléctrica negativa por lo que se desplaza hacia el polo positivo. Los fragmentos más pequeños se desplazan a mayor velocidad que los más grandes (Fig.) 

Figura 2.13. Representación esquemática de la técnica de Southern Blotting para el estudio de las secuencias específicas en el ADN genómico.



Con el electroforesis convencional se separan fragmentos entre 100 y 30.000 pares de bases. Cuando se marca con un colorante fluorescente (bromuro de etidio), el ADN separado de esta forma, aparece como una mancha homogénea de material fluorescente debido a que existen demasiados fragmentos de ADN como para que puedan diferenciarse entre sí. 

La técnica de Southern Blotting permite identificar uno o dos fragmentos de ADN de interés en el aparentemente uniforme colección de millón de fragmentos cortados con la enzima de restricción. El siguiente paso consiste en la desnaturalización de los fragmentos de cadena doble para obtener fragmentos de cadena única. Esto se logra con un bufer de Ph básico. 

La molécula de cadena única es transferida desde el gel a una membrana de nilón o a papel de nitrocelulosa, ayudado por capilaridad. 

La identificación de uno o más fragmentos de interés se logra con una sonda específica marcada con radioactividad o colorimetría. La sonda marcada se incuba con el filtro de nilón o nitrocelulosa en una solución que favorece la formación de ADN de doble cadena. Después de lavar el filtro, para retirar la sonda que no se unió a su cadena complementaria, el filtro se expone a un film de Rx durante 24 a 48 horas, para observar la posición de uno o más fragmentos a los que la sonda ha hibridizado, lo que se observa como una banda negra después del revelado. (Fig. ) 



Bibliografía:
Apuntes de clases Y
http://es.scribd.com/doc/7176351/Southern-Northern-Western-Blot











5.1. TECNICAS BASADAS EN PCR Y/O ELECTROFORESIS


5.1. TÉCNICAS BASADAS EN PCR y/o ELECTROFORESIS


La hibridación de ácidos nucleicos 

Es un proceso de unión de dos hebras complementarias de ácidos nucleicos pero cuyo origen es distinto. Una de ellas será el ácido nucleico diana y la otra será la sonda empleada para localizar ese ácido nucleico diana. 




¿Qué es una sonda? 

Una sonda es un fragmento monocatenario de DNA o RNA marcado con una molécula reporter, y que se emplea para el reconocimiento específico de una molécula determinada de ácido nucleico diana de cadena sencilla, en un proceso de hibridación. 

Existen tres tipos de sonda de ácidos nucleicos: 
  1. Fragmentos de DNA 
  2. Fragmentos de RNA 
  3. Oligonucleótidos sintéticos u oligosondas. 

¿Qué son las moléculas reporter? 

Son moléculas químicas unidas a la sonda y que van a permitir la detección de esta tras un proceso de hibridación. Existen moléculas reporter de muchos tipos: radiactivas (32P, 35S), de afinidad (Biotina, Digoxigenina...), enzimáticas (Fosfatasa, Peroxidasa ...) y quimioluminiscentes (ésteres de acridina). 

¿Qué factores afectan a la sensibilidad y especificidad de la reacción de hibridación? 
  • Concentración del ácido nucleico diana 
  • Complementariedad sonda-ácido nucleico diana 
  • Concentración de la sonda. 
  • Longitud de la sonda 
  • Actividad específica de la molécula reporter. 
  • Condiciones de hibridación (pH, fuerza iónica, temperatura de hibridación, ...) 
  • Tm 
  • Acceso al ácido nucleico diana. 
Bibliografía:
Apuntes de clases.

UNIDAD V: TECNICAS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR BIOTECNOLOGICO


4.4. BIOETICA Y REVOLUCION BIOTECNOLOGICA

BIOETICA Y REVOLUCION BIOTECNOLOGICA

En un contexto bioético quizá podría ser conveniente hacer una valoración general sobre lo que significa la introducción de genes humanos en organismos no humanos. Habría que distinguir dos situaciones diferentes: la primera, cuando la transferencia del gen humano al organismo no humano se hace en beneficio del propio hombre, y la segunda cuando la transferencia del gen humano al organismo no humano se hace exclusivamente en beneficio (o perjuicio) de este último. Desde el punto de vista bioético, la situación creada por la obtención de mamíferos transgénicos portadores de genes humanos para la obtención de proteínas terapéuticas humanas no es esencialmente nueva ya que, desde los primeros tiempos de la ingeniería genética molecular, se han introducido genes humanos en células bacterianas para obtener proteínas humanas (insulina, hormona de crecimiento, interferón, etc.). 

Tanto en el caso de las bacterias como de los animales transgénicos que se convierten en factorías naturales (biorreactores) de proteínas humanas, la valoración ética es positiva. En este último caso es importante señalar además que, al quedar restringida la expresión del gen humano a las células de la glándula mamaria, la fisiología y desarrollo del animal no se ven alterados y por tanto se evita cualquier daño a éste, quedando protegidos así los derechos de los animales.

En el segundo caso planteado, cuando la transferencia del transgén humano se realiza con el único propósito de influir en el desarrollo del animal, la valoración ética puede ser negativa si se producen anomalías importantes en su fisiología, como ocurrió en los cerdos que habían incorporado el gen humano de la hormona del crecimiento. Finalmente, en este contexto ¿podría decirse que algún gen humano concreto - en definitiva, un trozo de ADN - merecería un tratamiento o valoración ética diferente al resto? La respuesta lógica sería negativa, so pena de caer en una sacralización del ADN humano.

Bibliografía:
Apuntes de clases.

4.3. LEGISLACION

Herramientas Legales

  •  Agenda 21
  •  Constitución,
  •  Convenio de la Diversidad Biológica,
  •  Protocolo de Cartagena,
  •  Ley General de Salud,
  •  Ley Federal de Sanidad Vegetal,
  •  Ley sobre Producción, Certificación y Comercio de Semillas,
  •  Ley General de Equilibrio Ecológico y Protección al Ambiente,
  •  Ley de Desarrollo Rural Sustentable,
  •  [ Ley de Bioseguridad]
  •  Reglamentos
  •  Normas: FITO 056, [FITO-ECOL 200?]

Aspectos legales
Tanto en la normativa como en los artículos doctrinarios referidos a estas tecnologías se destacan dos grandes temas representativos: la necesidad de evaluar la cuestión desde una concepción precautoria y lo vinculado con las Patentes de Invención, Marcas y sus regalías.

El Principio de Precaución en cuestiones de nuevas tecnologías y sus posibles impactos ambientales tiene en cuenta: lo atinente a la protección del ambiente, previniendo daños a los ecosistemas y los intereses de las futuras generaciones, amparados en el artículo 41 de nuestra Constitución. “El principio de precaución funciona cuando la relación causal entre una determinada tecnología y el daño temido no ha sido aún científicamente comprobada de modo pleno”Prevención implica que la peligrosidad de la cosa o actividad es bien conocida y lo que se ignora es si el daño se producirá en un caso concreto, mientras que precaución sugiere que la incertidumbre recae sobre la peligrosidad misma de la cosa o actividad debido a que los conocimientos tecnológicos no son aún suficientes para dar respuesta concluyente al respecto. Este principio reclama medidas urgentes e inmediatas, aun cuando no hubiera pruebas o elementos científicos suficientes, es decir, impone una obligación de actuar con prudencia frente a las incertidumbres científicas. Por otra parte, debido a las tendencias del mercado hacia la uniformidad de los productos agrícolas como signo de mejor calidad y mayor eficacia en el manejo del producto desde la etapa productiva hasta la de distribución, se condicionan las características deseadas que deben cumplir los nuevos varietales. Este requisito de uniformidad y homogeneidad es imprescindible para el registro del nuevo varietal por parte del obtentor en la Unión para la Protección de Obtenciones Vegetales (UPOV).



Los derechos del obtentor de protección y patentamiento de variedades, para la UPOV, son aplicables al material de propagación uniforme y estable por generaciones; estas características facilitan su rápida aceptación. Pero estos criterios sólo influyen sobre los países miembros, por lo que en la Ronda Uruguay del GATT es aprobado el Acuerdo sobre los Aspectos de los Derechos de Propiedad Intelectual Relacionados con el Comercio, por el cual los miembros deberán otorgar protección a todas las obtenciones vegetales mediante patentes u otro sistema similar.


En algunos países esta “flexibilidad” con respecto al régimen de patentamiento se expresa a través de lo que se denomina “exenciones del obtentor”, en virtud de la cual utiliza una variedad protegida como fuente de una variedad “mejorada” o distinta. En la actualidad continúa el debate acerca del uso de ciertas tecnologías, como por ejemplo las llamadas “Terminator” (Tecnologías de Restricción de Uso Genético, TRUG), las que fueron desarrolladas inicialmente por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y la multinacional Delta&PineCo. Producen semillas estériles en la segunda generación; de esta manera el productor agropecuario no puede hacer reserva de semilla para la próxima cosecha, lo que atentaría contra los Derechos del Agricultor, reconocidos por la FAO en 1989.

En marzo de 2006, durante la 8ª Reunión del Convenio de Diversidad Biológica de la ONU (CBD) en Curitiba –Brasil- los Gobiernos Parte resolvieron por unanimidad mantener la moratoria internacional (aprobada hace seis años) sobre las Terminator, a pesar de la oposición de Canadá, Australia y Nueva Zelanda, que proponían una “evaluación de riesgos caso por caso”, opción que abriría la posibilidad de que cada gobierno permitiera pruebas de campo sin reparar en su impacto. El 16 de marzo, el Parlamento Europeo publicó una Resolución llamando a los gobiernos europeos a mantener la moratoria en el CDB y rechazar el texto donde se proponía “caso por caso”. No obstante, Terminator podrá ser comercializado en aquellos países donde los gobiernos nacionales no lo prohíban expresamente.

En las útimas décadas se puede constatar que las nuevas variedades han sido registradas por empresas multinacionales que han ido adquiriendo a las empresas más pequeñas productoras de semillas y son además las que controlan el mercado de agroquímicos específicos de los que detentan las patentes, estableciendo alianzas estratégicas o fusiones con otras coorporaciones de similares características pero del  área farmacéutica y de la cadena de producción y distribución de alimentos. De esta manera el control del ciclo completo a nivel mundial queda en manos de unas pocas compañías Si bien la biotecnología responsable puede ofrecer grandes beneficios, las autoridades de regulación y control, responsables de la evaluación de los procedimientos deben actuar eficazmente en el mejoramiento y la bioseguridad de los productos y sus derivados. 


La mejora genética aplicada al agro en la legislación nacional

En nuestra legislación la mejora genética aplicada al agro, comienza a tener relevancia con la sanción de la Ley n° 12.253, en la cual en sus artículos 22 al 27 -Fomento a la Genética-, se establecen los procedimientos a seguir y las autorizaciones necesarias para la comercialización y fiscalización de las nuevas variedades de semillas; la Ley n° 13.636 -Fiscalizadora de la elaboración y comercialización de Productos Veterinarios- y la Defensa Sanitaria de la Producción Agrícola a través del Decreto-Ley n° 6.704, 12 agosto 1963 y modificatorias.

La mejora genética aplicada a la cría de animales establecida por la Ley n° 20.425 , regula la fiscalización por parte del Estado Nacional de las actividades relacionadas con la inseminación artificial de animales, mientras que la Resolución SAGyP n° 304, 27 abril 1988 , controla la transferencia embrionaria de animales. 

En 1970 se crea una Comisión de Estudio que estará a cargo de la elaboración de un anteproyecto de ley de semillas, y es en base a este texto que se sanciona la Ley n° 20.247 de Semillas y Creaciones Fitogenéticas, en virtud de la cual se crea la Comisión Nacional de Semillas, el Registro Nacional de Cultivares y el Registro Nacional de la Propiedad de Cultivares, encargadas de la fiscalización, evaluación y registro de las obtenciones vegetales y son derogados los artículos mencionados de la Ley n° 12.253 de Granos y Elevadores.
El Decreto n° 2.183, 21 octubre 1991 aprueba una nueva reglamentación de la Ley de Semillas, derogando las anteriores reglamentaciones parciales. Posteriormente, la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca crea la Comisión Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria (CONABIA) -Resolución n° 124 del 24 de octubre de 1991 -, designándola como autoridad de control en la ejecución de planes y políticas en materia de tecnología agropecuaria y agroindustrial. Dicha Comisión, integrada por representantes del sector público (UBA, CONICET, SECYT, INASE, SENASA) y privado (Foro Argentino de Biotecnología, Asociación de Semilleros, Cámara de Productores Sanitarios y Fertilizantes, Cámara de Productos Veterinarios, Sociedad Argentina de Ecología) realizará las evaluaciones de las solicitudes de experimentación con este tipo de material genético. Esta norma fue modificada por la Resolución SAGPyA n° 244, 18 febrero 2004 , en relación con la inclusión de la acuicultura y la definición de nuevas políticas y normas.

Las primeras liberaciones al medio de organismos genéticamente modificados son autorizadas en 1991. Se trata de liberaciones “a campo” de Algodón, con resistencia a insectos (gen Bt), empresa solicitante Calgene Inc.; con tolerancia al Bromoxynil (gen Bxn); Soja, con tolerancia a glifosato, empresa solicitante Nidera S.A. y Maíz para evaluación de genes marcadores, empresa solicitante Ciba Geigy Arg. SAIC. Recién en 1992 la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca emite la Resolución n° 656, 30 julio 1992, que establece las normas para el diligenciamiento de los permisos para experimentación y/o liberación al medio de Organismos Vegetales Genéticamente Modificados (OVGM), microorganismos genéticamente modificados y/o sus productos para aplicaciones en animales. Fue modificada por su similar n° 837, 9 septiembre 1993 y por la Resolución SAGPyA n° 289, 9 mayo 1997, por las cuales se actualizan los Anexos I y II. Esta última fue derogada por su similar n° 39, 11 julio 2003 por la que se estipulan las características de la evaluación.

Etapa de evaluación para las liberaciones (2 fases): 

· Evaluación de liberaciones experimentales a fin de determinar la probabilidad de que los efectos sobre el ambiente no sean significativos.
· Evaluación de liberaciones extensivas (flexibilización) a fin de determinar que no generarán un impacto sobre el ambiente que difiera significativamente del que produciría el organismo homólogo no GM.

Etapa de comercialización de los OVGM (3 fases): 

· Evaluación de riesgos para los agrosistemas derivados del cultivo a escala comercial de los OVGM, mínimo 2 años.
· Evaluación del material para uso alimentario, humano y animal que compete al SENASA, mínimo 1 año. (Evalúa tóxicos naturales, tóxicos de nueva expresión, homología del producto del transgen con alergenos conocidos, modificaciones nutricionales, modificación nutricional y caracterización asignable a métodos de elaboración, modificación de la biodisponibilidad de macronutrientes y/o micronutrientes, inocuidad para el consumo humano y animal).
· Dictamen sobre la conveniencia de la comercialización del OVGM por su impacto en los mercados emitido por la Dirección Nacional de Mercados Agroalimentarios, los requisitos del INASE para la inscripción en el Registro Nacional de Cultivares y la fiscalización.

Bibliografía:
http://www.biblioteca.unp.edu.ar/bcentral/Doc_digitales/Organismos%20Geneticamente%20Modificados%20_OGM_%20Usos%20Alimentarios.PDF



4.2.5.2. ANIMALES TRANSGENICOS


Normalmente, en los organismos superiores animales o vegetales la información genética se transmite por mecanismos de reproducción sexual; es lo que se conoce como transmisión genética vertical. Sin embargo, hace ya unos veinte años se logró obtener los primeros ratones transgénicos mediante transferencia génica por inyección directa de ADN extraño en un cigoto obtenido por fecundación in vitro; es decir, se trataba de una transmisión genética horizontal, también llamada transgénesis. A partir de las experiencias de Gordon, Ruddle y colaboradores iniciadas en 1980 en las que inyectaron ADN de ratón en uno de los pronúcleos de un cigoto de la misma especie, se inició una nueva era en la manipulación genética de embriones de mamíferos. Al año siguiente, Gordon y Ruddle (1981) demostraban la integración y transmisión estable a través de la línea germinal de genes inyectados en pronúcleos de cigotos de ratón obtenidos por fecundación in vitro. Eran los primeros ratones transgénicos. El paso siguiente consistió en probar que también se podían obtener ratones transgénicos que incorporaran en su genoma un gen (transgén) de otra especie. Así, Palmiter y colaboradores (1982) obtuvieron ratones transgénicos gigantes al inyectar en el pronúcleo de un cigoto el gen de la rata que codifica para la hormona del crecimiernto. Incluso, se obtuvieron también ratones transgénicos gigantes cuando el transgén introducido era el gen humano que codifica para la hormona de crecimiento (Palmiter et al., 1983).


3505.- El ratón transgénico, que lleva incorporado el gen de la hormona de crecimiento de la rata, tiene un aumento de tamaño del 80% en comparación con un ratón normal. Como era de esperar, a los ratones transgénicos siguieron los conejos, ovejas y cerdos transgénicos a los que se les había introducido por microinyección en uno de los pronúcleos del cigoto el ADN del gen humano que codifica para la hormona de crecimiento, en un intento de aumentar el tamaño de tales animales (Hammer et al., 1985). Sin embargo, este avance científico no tuvo aplicación zootécnica porque la presencia del transgén modifica la fisiología del animal transgénico, produciendo efectos colaterales perjudiciales para su desarrollo. De cualquier manera, la era de la trangénesis animal había comenzado como una realidad imparable.
4092.- Cerdo transgénico que lleva incorporado el gen humano de la hormona del crecimiento. Su desarrollo presentaba trastornos fisiológicos importantes (Fuente: M.R.Cummings, 1995, Herencia Humana, 3ª edición, Interamericana)




MAMÍFEROS TRANSGÉNICOS


Como se indicaba anteriormente, las investigaciones llevadas a cabo a principio de los años ochenta no fueron más que el lanzamiento de una serie ininterrumpida de avances, tanto en la investigación básica como en la utilización práctica de los animales transgénicos. En el cuadro adjunto se incluyen los principales hitos relacionados con la obtención y desarrollo de los mamíferos transgénicos:

1938: Spemann propone experimento de transferencia nuclear
1949: Hammond mantiene embriones de ratón en cultivo in vitro
1961: Tarkowski obtiene ratones quiméricos agregando embriones
1966: Lin describe la técnica de microinyección de embriones de ratón
1980: Gordon, Ruddle y col. obtienen los primeros ratones transgénicos por microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos de ratón
1981:
Gordon y Ruddle obtienen ratones transgénicos por microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos de ratón.
Evans y Kaufman obtienen células embrionarias totipotentes de ratón
1982: Palmiter y col. obtienen ratones transgénicos gigantes mediante transgenes de la hormona del crecimiento de la rata
1983:
Palmiter y col. obtienen ratones transgénicos gigantes mediante transgenes de la hormona de crecimiento humana.
McGrath y Solter desarrollan una nueva técnica para experimentos de transferencia nuclear en ratón
1985: Hammer y col. obtienen animales de granja transgénicos (conejos, ovejas, cerdos) con el transgén de la hormona del crecimiento humano
1987: Thomas y Capecchi obtienen los primeros ratones knockout por recombinación homóloga
1989: Clark y col. obtienen ovejas transgénicas con el gen humano del factor IX de coagulación de la sangre mediante microinyección de ADN en el pronúcleo del cigoto
1991:
Wright y col. obtienen ovejas transgénicas con el gen humano de la a -1-antitripsina mediante microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos.
Ebert y col. obtienen cabras transgénicas con el gen AtPH humano (activador tisular de plasminógeno) mediante microinyección de ADN en pronúcleo de cigoto.
Krimpenfort y col. obtienen vacas transgénicas con el gen humano de la lactoferrina mediante microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos.

1993:
Nagy y Rossant obtienen ratones quiméricos por co-cultivo de embriones.
Schedl y col. obtienen ratones transgénicos con cromosomas artificiales de levaduras
1994: Brinster y col. obtienen ratones transgénicos por transplante de espermatogonias
1996: Campbell y col. obtienen ovejas clónicas por transferencia nuclear de células embrionarias en cultivo
1997:
Wilmut y col. obtienen ovejas clónicas por transferencia nuclear de células diferenciadas fetales y adultas en cultivo
Schnieke y col. obtienen ovejas clónicas transgénicas por transferencia nuclear a partir de células fetales diferenciadas
1998: Cibelli y col. obtienen vacas clónicas transgénicas por transferencia nuclear a partir de células fetales diferenciadas
1999:
Baguisi y col. obtienen cabras transgénicas por transferencia nuclear
Yanagimachi y col. obtienen ratones transgénicos mediante la co-inyección de cabezas de espermatozoides y ADN exógeno

Las técnicas de obtención de animales transgénicos son:

  1.  Microinyección de ADN en núcleo de ovocito
  2.  Microinyección de ADN en pronúcleo o en citoplasma de cigoto (óvulo fecundado)
  3.  Electroporación de cigoto
  4.  Transfección de células totipotentes
  5.  Co-inyección en ovocitos de una mezcla de cabezas de espermatozoides y ADN exógeno
  6.  Vectores virales
  7.  Transfección de gametos
  8.  Transferencia de núcleos transfectados (clonación)
  9.  4149.- Técnica de obtención de ratones transgénicos mediante microinyección de ADN en el pronúcleo masculino de un cigoto obtenido por fecundación in vitro (Fuente: H. Lodish et al., 1995, Molecular and Cell Biology, Scientific American Books)
LAS GRANJAS FARMACÉUTICAS


La Biotecnología ha aplicado estas técnicas experimentales de transgénesis y ya hoy se están estableciendo las primeras granjas farmacéuticas en las que se crían ovejas, cabras, vacas o cerdos transgénicos que producen en su leche proteínas terapéuticas humanas (ver Velander et al., 1997). La manipulación genética de un mamífero doméstico transgénico consiste, en primer lugar, en preparar el fragmento de ADN que contiene el gen humano, uniéndolo a otro fragmento de ADN correspondiente a un elemento regulador (promotor) procedente de un gen que promueve la síntesis de una proteína de la leche (por ejemplo, la b -lactoglobulina, la caseína, etc.). De esta manera se asegura que el gen humano sólo se expresará en las células de las glándulas mamarias del animal transgénico (oveja, cabra, vaca, cerdo) obtenido tras la inyección del ADN manipulado en el pronúcleo masculino de un cigoto producido por fecundación in vitro. Sin embargo, actualmente, la utilización de la técnica de clonación por transferencia de núcleos de células genéticamente modificadas resulta más ventajosa. Con esta última técnica, los investigadores del Roslin Institute de Edinburgo obtuvieron por vez primera en 1997 ovejas transgénicas procedentes de núcleos de fibroblastos fetales a los que se les había introducido el gen humano que codifica para el factor IX de coagulación de la sangre (Schnieke et al., 1997). Los resultados de estos autores demostraron además que la utilización de la técnica de clonación de los núcleos modificados genéticamente es mucho más eficaz que la técnica original de microinyección de ADN en los pronúcleos de los cigotos. Posteriormente, con estas técnicas se ha conseguido que la leche de las hembras transgénicas contenga también otras proteínas terapéuticas humanas (a -1-antitripsina, proteína C, factor VIII de coagulación, antitrombina III, etc.) que pueden luego ser fácilmente separadas de las restantes proteínas propias del animal. Además es importante señalar que el animal transgénico no se ve perjudicado en su desarrollo porque el gen humano sólo se expresa en las células de las glándulas mamarias debido al regulador específico al que se le ha asociado y, por tanto, en las restantes células del animal no se sintetiza la proteína humana al estar silenciado el gen humano. En consecuencia, el animal doméstico ha sido convertido en un gran biorreactor sin perjuicio aparente para él. Las primeras granjas farmacéuticas fueron establecidas por compañías biotecnológicas como Pharmaceutical Proteins Ltd (PPL) en Escocia (1500 ovejas), Genzyme Transgenics en Estados Unidos (1000 cabras), Gene Pharming Europe en Holanda (vacas), etc. Otros grupos de investigación son partidarios de la utilización de las granjas de cerdos transgénicos dado su corto tiempo de gestación (cuatro meses), el intervalo generacional (un año) y el mayor tamaño de las camadas (10 a 12 lechones), teniendo en cuenta además que una cerda lactante produce unos 300 litros de leche al año. Las cifras económicas demuestran la importancia futura de las granjas farmacéuticas : el mercado de proteínas terapéuticas, que actualmente se obtienen principalmente mediante fermentación o cultivo celulares, se estima en unos 7.600 millones de dólares anuales y se calcula que podrá llegar a ser de 18.500 millones de dólares el año 2000. Las cifras expresadas parecerían justificar las enormes inversiones que es necesario hacer para obtener animales transgénicos, tal como se indica en el cuadro adjunto:

Ovejas transgénicas: Los pacientes de enfisema hereditario necesitan ingerir grandes dosis de a -1-antitripsina para suplir su deficiencia en plasma, donde la concentración es de 2 mg/ml. Pues bien, en el Roslin Institute de Edinburgo, en colaboración con la empresa PPL, se han obtenido por diversos procedimientos ovejas transgénicas portadoras del gen humano que codifica para la a -1-antitripsina (unido al promotor de la b -lactoglobulina para que se exprese exclusivamente en las células de la glándula mamaria. Así, el grupo que dirige el Dr. Ian Wilmut microinyectaron 549 cigotos con el ADN del gen humano unido al promotor del gen de la b -lactoglobulina de oveja, obteniendo 113 individuos de los que cinco (un cordero y cuatro ovejas) eran transgénicos. Las ovejas producían más de 1 mg/ml de a -1-antitripsina en la leche e, incluso, una de ellas, que presentaba un mayor número de copias del transgén integradas en el genoma, llegó a producir hasta 63 mg/ml durante la primera semana, pero luego se estabilizó en 35 mg/ml (Wright et al., 1991). El mismo grupo de investigación ha obtenido también ovejas transgénicas portadoras del gen humano que codifica para el factor IX de coagulación de la sangre (antihemofílico), primero mediante la técnica de microinyección en el pronúcleo del cigoto del correspondiente gen humano (ADNc) unido al promotor del gen de la b -lactoglobulina de la oveja (Clark et al., 1989) y más tarde mediante la técnica de clonación: transferencia de núcleos de fibroblastos fetales genéticamente modificados (Schnieke et al., 1997).


Cabras transgénicas: Las cabras también pueden constituir unos buenos biorreactores de proteínas humanas puesto que producen 4 litros/día de leche y sus períodos de gestación y de desarrollo son cortos (5 y 8 meses, respectivamente). Así, Ebert et al. (1991) obtuvieron cabras transgénicas portadoras del gen humano que codifica para el activador tisular de plasminógeno (AtPH) que, al estar unido al promotor del gen de la b -caseína de la cabra, producía hasta 2-3 mg/ml de AtPH en la leche del animal. La proteína podía ser aislada con una pureza del 98% y una actividad específica de 610.000 U/mg (Denman et al., 1991).


Vacas transgénicas: La gran producción lechera de las vacas (10.000 litros/año, 35 g proteína/litro de leche) las convierte en poderosos biorreactores de proteínas humanas. En 1991, tres grupos de investigación de Holanda (la Universidad de Leiden, la empresa Gene Pharming Europe y el Instituto de Producción Animal de Zeist) obtuvieron vacas transgénicas portadoras del gen humano de la lactoferrina que se sintetizaba en la leche del animal por estar unido al promotor de la a -S1-caseína bovina. Así, Krimpenfort et al. (1991) inyectaron 1.154 pronúcleos de otros tantos cigotos obtenidos por fecundación in vitro, de los cuales sobrevivieron 981. A los 9 días transfirieron 129 embriones a vacas estimuladas hormonalmente (pseudopreñez), quedando 21 de ellas preñadas y sólo 16 llevaron a término la gestación. Se obtuvo un macho y una hembra (que era un mosaico). El macho dio positivo para la presencia del gen humano en todos los tejidos analizados (placenta, oreja y sangre), estimándose que era portador de 5 a 10 copias del gen humano. Más tarde, otro grupo de investigación (Cibelli et al., 1998) obtuvo tres terneros clónicos transgénicos que llevaban el trasgén híbrido b -gal-neo que se expresaba con un promotor muy potente del citomegalovirus. En el caso de las vacas, otros objetivos pueden ser la aplicación de la técnica conocida como "modelo de la glándula mamaria" para reducir la lactosa (para los casos de intolerancia) o fabricar "in vivo" leche maternizada, suprimiendo mediante la técnica de "knockout" del gen de la b -lactoglobulina de la leche de vaca para imitar a la leche humana que no la tiene.

Animales trasgenicos:


Bibliofgrafía:
apuntes de clases.

4.2.5.1. PLANTAS TRANSGENICAS



Los transgénicos son organismos a los cuales se han introducido uno o más genes provenientes de otra especie. Las plantas transgénicas poseen genes de todas las procedencias: de otras plantas, de animales, de bacterias, de virus y de hongos, y muchas veces poseen combinaciones de ellos, ya que se necesitan armar complejos sistemas moleculares para garantizar la expresión de los genes foráneos. 

En las plantas transgénicas se han usado genes de plantas, animales y bacterias para conferirles características puntuales como resistencia a químicos, a condiciones ambientales adversas, a insectos, etc. a los cuales se añaden genes promotores y regulares de elevada expresión (llamados convencionalmente enhancers) provenientes de virus, puesto que éstos tienen mayor capacidad de expresión que los celulares (por las características infecciosas de los virus, que hacen que el sistema de expresión tenga prioridad con su genoma antes que con el de la célula) y de esta forma de garantiza que el material introducido se transcriba y se traduzca. Para la construcción de transgénicos además se usan genes de resistencia a 4 antibióticos que sirven como marcadores de selección, para separar las células transformadas de las no afectadas.

El desarrollo de la ingeniería genética (también llamada metodología del ADN recombinante) fue posible gracias al descubrimiento de las enzimas de restricción y de los plásmidos.


Beneficios de las plantas transgénicas 
  • Resistencia a insectos
  • Resistencia a herbicidas
  • Mejora de la productividad y producción
  • Mejora de la calidad nutritiva
  • Control de enfermedades virales
  • Tolerancia al estrés ambiental
  • Producción de frutos más resistentes
  • Producción de plantas bioreactoras
  • Fijación de nitrógeno
  • Mejora con fines ornamentales
  • Producción de fármacos y vacunas

OBTENCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS 

Principalmente se emplean tres métodos para introducir genes ajenos en una planta.

a) El método se basa en el empleo de un vector vivo que lleve el material genético a la célula
blanco. Existen dos formas de introducir material genético por esta vía: 
1) Mediante virus genéticamente modificados (que llevan los genes de interés en lugar de los genes estructurales), los cuales insertan su genoma en el DNA celular para la replicación y de esta manera se consigue la expresión de los genes foráneos. 

2) el mecanismo natural de infección de la bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens que introduce un gen de su plásmido en las células de la planta infectada. Recordemos que un plásmido es un fragmento de ADN circular y extracromosómico que suele contener información no vital para la bacteria y cuyo tamaño es del orden del 1 al 3% del cromosoma bacteriano. Este gen se integra en el genoma de la planta provocándole un tumor o agalla. Lo que se hace con A. tumefasciens, es crear una cepa recombinante de ésta (con los genes de interés) y se induce la formación de tumores, en los cuales se encuentran células modificadas por la interacción, se aíslan estas células y a partir de ellas se genera el individuo transgénico

b) Otro método empleado para transformar genéticamente plantas es el uso deprotoplastos, que son células vegetales a las que se les ha liberado de la pared celular. De esta manera queda eliminada la barrera principal para la introducción de genes foráneos. Mediante esta técnica se consiguió por primera vez cereales transgénicos en 1988. Puede realizarse una transferencia directa de genes mediante la fusión de protoplastos (la célula vegetal sin la pared) mediante químicos como el PEG (polietilenglicol), de donde se obtienen híbridos nucleares y luego células transgénicas por recombinación; para este in también puede emplearse liposomas. 

c) La biolística es otro método difundido, consiste en bombardear las células con partículas metálicas microscópicas recubiertas del DNA que se desea introducir. Si bien esta técnica ha dado buenos resultados, tiene un componente aleatorio de efecto muy fuerte que da un amplio margen a resultados impredecibles y un incremento significativo en la tasa de mutación celular. Igualmente costosos, pero con menos problemas de efecto aleatorio, están los métodos de inyección (micro y macroinyección), estos métodos consisten en inyectar el material genético foráneo al núcleo de la célula mediante equipo sofisticado. Los métodos de microinyección tienen mayor eficacia que los de macroinyección por la focalización dirigida de la inserción. Adicionalmente se emplean otros métodos directos como la transformación del polen y la electroporación, pero no son ampliamente utilizados. Microcañón o cañón de partículas que consiste en bombardear tejidos de la planta con micropartículas metálicas cubiertas del fragmento de ADN que interesa se integre en el ADN de la planta. Es el procedimiento que más éxitos ha conseguido y el que promete más avances. 

Plantas trasgenicas ejemplos:

Bibliografía:
http://www.uned.es/experto-biotecnologia-alimentos/TrabajosSelecc/TrinidadSanchez.pdf


4.2.5. TECNOLOGIA DE ADN RECOMBINANTE EN LA AGRICULTURA

También es posible evitar los métodos tradicionales de mejora genética y transferir directamente las características deseables a animales y plantas importantes desde el punto de vista de la agricultura. Estas técnicas tienen la capacidad de aumentar las tasas de crecimiento y la producción global de proteínas de los animales de granja. El gen que codifica la hormona del crecimiento ya ha sido transferido de ratas a ratones, y los métodos de fertilización in vitro e implantación de embriones han alcanzado un nivel de desarrollo relativamente alto. Recientemente, se ha utilizado la hormona del crecimiento bovina para aumentar la producción de leche al menos un 10%. Es posible que también puedan mejorarse la resistencia a la enfermedad y la tolerancia a condiciones ambientales extremas de los animales de granja. 

Se ha invertido un esfuerzo considerable en la transferencia a otras plantas de cultivo de las capacidades fijadoras de nitrógeno de las bacterias asociadas a las leguminosas. Los principales genes responsables de este proceso se han clonado y transferido al genoma de las células de plantas; sin embargo, las células receptoras no han sido capaces de fijar el nitrógeno. Si se tuviera éxito en este proyecto, los beneficios potenciales para plantas de cultivo tales como el maíz serían importantes. No obstante, existe cierta preocupación en torno al hecho de que las nuevas variedades fijadoras de nitrógeno pudieran propagarse de forma indiscriminada como malas hierbas o alterar el ciclo de nitrógeno del suelo. 

Los intentos de conferir a las plantas resistencia a las condiciones ambientales adversas han tenido más éxito. Por ejemplo, se aislaron de Salmonella los genes responsables de la detoxificación de los herbicidas basados en el glifosato, y se introdujeron en células de la planta del tabaco utilizando el plásmido Ti. Las plantas regeneradas a partir de las células recombinantes eran resistentes al herbicida. También se han desarrollado variedades de algodón y de maíz fértil transgénico resistentes a los herbicidas. Este hecho tiene una importancia considerable, ya que numerosas plantas sufren efectos adversos al ser tratadas con herbicidas. Las plantas de cultivo resistentes no sufrirían ningún efecto derivado de los agentes químicos empleados para el control de las malas hierbas, y las cosechas probablemente serían mucho mayores. 

Se están explorando muchas otras aplicaciones en agricultura. Un buen ejemplo lo constituye una cepa alterada de Pseudomonas syringae que protege a las plantas de los daños por congelación porque no puede producir la proteína que induce la formación de cristales de hielo. Se está invirtiendo un gran esfuerzo en la protección de las plantas frente a plagas sin el uso de pesticidas químicos y se está estudiando una cepa de Pseudomonas fluorescens que contiene el gen que codifica la toxina de Bacillus thuringiensis. Esta toxina destruye muchas plagas de insectos, como la mariposa de la col y el gusano barrenador del maíz. También se ha desarrollado una variedad de maíz que contiene el gen de la toxina de B.thuringiensis. Existe un interés considerable por los virus destructores de insectos, y en particular por los baculovirus. Se ha insertado un gen que codifica la toxina del escorpión en el virus multicápside de la polihedrosis nuclear (AcMNPV). Este virus, desarrollado mediante ingeniería genética, mata a la mariposa de la col con mayor rapidez que el virus normal, y reduce de forma significativa los daños en el maíz. 
Finalmente, se están desarrollando cepas de soja, patata, calabacín, arroz y otras plantas, resistentes frente a virus.

Bibliografía:
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/DNA-recombinante/Tecnica%20DNA%20recombinante.pdf

4.2.4. VECTORES DE CLONACION




Los vectores son unidades de ADN que se autoreplican en un microorganismo o células humanas y los cuales pueden portar fragmentos de ADN de origen diverso. El vector debe contar con los elementos que le permitan ser replicados y mantenidos por la maquinaria celular hospedadora. 

Los vectores son propagados en hospedadores que pueden ser células de E. coli, levadura (S. cerevisiae) o células mamíferas. Los vectores pueden ser estructuras sencillas como plásmidos o muy complejos como los cromosomas artificiales de levadura (YAC) (5) y los cromosomas artificiales mamíferos (MAC) (6). 

los vectores tienen diferente capacidad de portar longitudes variables de secuencias de ADN. Los cromosomas artificiales mamíferos se vislumbran como vectores de terapia genética de condiciones causada por genes mayores como el de la distrofina, cuya disfunción causa la distrofia muscular de Duchenne-Becker, gen que tiene una longitud de secuencia de 2.4 Mb (7).


TIPOS de VECTORES y HOSPEDADORES
VECTOR
HOSPEDADOR
ESTRUCTURA
CAPACIDAD kb
Plásmidos
Bacteriófagos
Cósmidos
BACs
YACs
MACs
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
Levadura
Células mamíferas
Plásmidos Circulares
Plásmidos Circulares
Plásmidos Circulares
Plásmidos Circulares
Cromosomaslineales
Cromosomaslineales
5-10
5-10
35-45
hasta 300
100-2000
>1000


Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación.



Figura a En esta secuencia de dibujos se puede ver como se realiza la inserción de un gen en un plásmido. En la figura a tenemos un gen(color rojo) que interesa insertar en un plásmido (color turquesa)




Figura b. En la figura b, vemos como una enzima de restricción ha cortado el gen y el plásmido, quedando unos bordes cohesivos o pegajosos.




Figura c .La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonación, se realiza por medio de otras enzimas, denominadas ADN-ligasas, que unen ambos trozos de ADN. El resultado es una molécula de ADN recombinante, ya que contiene fragmentos de ADN de distinta procedencia.



Plásmido R:  La resistencia a ciertos antibióticos y otras drogas puede ser transferida de una célula bacteriana a otra por este tipo de plásmido. La resistencia a las drogas generalmente es el resultado de la síntesis de enzimas que degradan la droga o que establecen una nueva vía enzimática para eludir los efectos.

El plásmido usado en ingeniería genética debe tener un número limitado de sitios de restricción y genes de resistencia a antibióticos específicos. Ésta característica permitirá su rastreo. Si el plásmido utilizado presenta genes resistentes a la ampicilina y a la tetraciclina y los sitios de restricción están dentro de estos genes, el objetivo será mediante una enzima de restricción cortar la molécula de ADN por un sitio que esté incluido dentro de uno de los genes resistente a antibióticos, el cual quedará inactivo. Si el ADN a recombinar se inserta dentro del gen de resistencia a la tetraciclina éste se inactivará, quedando activado el gen de resistencia a la ampicilina.

La célula que contenga el plásmido recombinante podrá identificarse ya que será resistente a la ampicilina y sensible a la tetraciclina. Un cultivo en placa que contenga el antibiótico ampicilina permitirá que se desarrollen sólo las colonias que hayan incorporado el plásmido.

Bacteriófagos: No penetran en la célula como otros virus, sino que se adosan a la pared celular y entran en contacto con la célula bacteriana mediante las fibras de cola (pie). Practican un orificio en la bacteria e inyectan, mediante la contracción de su cola, el ADN que se encuentra en su cabeza.
Luego de la infección comienza la síntesis propia del virus utilizando la maquinaria celular del huésped para su reproducción. Al cabo de un corto período se encontrarán dentro de la célula muchos bacteriófagos (fagos) nuevos; la célula bacteriana se lisa (colapsa), liberando los hijos del virus que estarán en condiciones de infectar a otras bacterias.

Para clonar por medio del vector  l se corta el ADN vírico en dos sectores con una enzima de
restricción, separando su zona central y quedando dos fragmentos que serán aislados para ser ligados con ADN ligasa al ADN foráneo que previamente fue cortado con la misma enzima. La parte central es descartada pues no afecta la capacidad del fago l para infectar células. Una vez obtenida la molécula recombinante se introduce en la célula hospedadora por medio de transfección y se sintetizan fagos descendientes infectivos que contendrán el ADN insertado.

Cósmidos:  Los vectores híbridos, constituidos por parte del cromosoma del fago l y el ADN
plasmídico, permiten la clonación de fragmentos largos de ADN foráneo.
Durante la clonación las moléculas de ADN recombinante se empaquetan en la cubierta proteica del
fago y una vez que el cósmido entra en la célula huésped se replica como un plásmido.
El ADN plasmídico posee genes resistentes a antibióticos que permitirán identificar las células
plasmídicas que los contiene.
Ejemplo de vector:  Agrobacterium tumefaciens (Gram -) –Atu-, posee un plásmido Ti que es el
responsable de su virulencia. Al transferirse al vegetal este segmento de ADN (T-ADN) puede contener el ADN
a transferir entre las secuencias de sus extremos (vector binario: contiene dos plásmidos, uno es el gen
implantado y el otro es el marcador de resistencia a un antibiótico –kanamicina- para vegetales). Posee un origen de replicación igual que el de la  Escherichia coli –Eco- (organismo hospedador para la clonación). Se transforma en Eco, luego se tranfiere por conjugación a Atu. Para completar el proceso la Atu debe contene la otra parte del sistema de vector binario transfiriendo el T-ADN a la planta.  Este otro plásmido contiene una región de virulencia (vir) de un plásmido Ti desactivado (D- Ti), que dirige la transferencia pero no posee los genes que provocan la enfermedad.


Luego de la recombinación con un cromosoma del hospedador el ADN foráneo se expresará  y conferirá las nuevas propiedades a la planta. Tipos de plantas tratadas: dicotiledóneas (tomate, papa, tabaco, soja, alfalfa, algodón) o leñosas (nogal y manzano). monocotiledóneas (gramíneas) son tratadas con mayor éxito con el método de disparadores de partículas.


Bibliografía:
APUNTES DE CLASES. Y
http://www.biblioteca.unp.edu.ar/bcentral/Doc_digitales/Organismos%20Geneticamente%20Modificados%20_OGM_%20Usos%20Alimentarios.PDF

4.2.3. CLONACION DE GENES

Clonación de genes:
 el proceso mediante el cual puede aislarse un gen de entre todos los genes diferentes que existen en un organismo, lo que permite realizar su caracterización. Esto se consigue con la preparación de una batería de bacterias que contienen todos los genes distintos presentes en un organismo de manera que cada una de ellas contiene un solo gen. Esto se lleva a cabo efectuando cortes del ADN de un individuo. Otra alternativa es la de crear un conjunto de todas las secuencias de ADN expresadas en una célula específica mediante la producción de copias complementarias de ADN a partir del ARNm hallado en dichas células (v ase Biología molecular). En ambos casos, los fragmentos de ADN se unen a un vector, un virus bacteriano conocido como bacteriófago o a un ADN circular denominado plasmido, que se introduce en una bacteria de forma que cada una adquiere solo una copia del vector y por tanto recibe solo un fragmento de ADN.

Los grupos preparados de esta forma se pueden examinar para identificar la bacteria que contiene el gen objeto de estudio. Entonces, se toma esta bacteria y se hace crecer para producir un clon de bacterias idénticas. Como el vector que contiene el ADN insertado se replica siempre que la célula bacteriana se divide, se produce la cantidad suficiente de ADN insertado clonado necesaria para caracterizar el gen. De esta manera es posible estudiar los genes que codifican proteínas que tienen un interés especial, o aquellos cuya inactivación, consecuencia de una mutación, origina una enfermedad específica. Por ejemplo, podemos determinar su secuencia y la naturaleza de la mutación que da lugar a una enfermedad.

Con posterioridad, el gen se puede expresar en la célula bacteriana para producir la proteína específica que se puede emplear en el tratamiento de enfermedades como la diabetes mellitus (insulina) o el enanismo (hormona del crecimiento). Recientemente, se han podido introducir genes funcionales clonados en los individuos, para tratar una enfermedad de forma más directa. Es probable que el empleo de estos procedimientos de tratamiento genético con ADN clonado aumente en el futuro.

Metodos de clonacion:

Partición: En esta técnica se utilizan embriones octocelulares, en estadode preimplantación. A partir del embrión seleccionado, se toman mitades o secciones que posteriormente se introducen dentro de zonas pelúcidas naturales o artificiales. A continuación, se efectúa la implantación del producto en el endometrio. El número máximo de células del embrión, no puede ser superior a 8, porque a partir de este momento, se inicia la expresión del genoma embrionario. Los individuos obtenidos son prácticamente idénticos entre sí, aunque diferentes a los progenitores, por lo cual se considera que son el equivalente de los gemelos monocigóticos.

Clonación por transferencia nuclear de células somáticas (SCNT: Somatic Cell Nuclear Transfer): los requisitos mínimos para la SCNT incluyen el uso de dos tipos de células: somáticas o no sexuales, y sexuales femeninas, u oocitos. Los núcleos de células somáticas de individuos postnatales se transfieren dentro de oocitos o de cigotos enucleados.Esta técnica tiene la ventaja que permite conservar el genoma durante la diferenciación celular y la capacidad del citoplasma celular para reprogramar la actividad génica y aumentar la redireccionalidad de la diferenciación celular. Sin la aplicación de estos dos principios, la clonación no es posible.

Para clonar a un ser vivo mediante SCNT, se extrae el material genético de ambos tipos de células y, a continuación, se inyecta el núcleo de la célula somática que se desea clonar (donante), dentro del oocito previamente enucleado (receptor). El transplante de núcleos somáticos dentro de oocitos enucleados tiene como fin reproducir los procesos bioquímicos y fisiológicos que, de manera natural, se desencadenan durante la fertilización.

Paraclonación: Consiste en inyectar núcleos de células madre embrionarias en cultivo, dentro de oocitos enucleados y, a veces, de cigotos nucleados. Los blastómeros se obtienen a partir de varias fuentes como la masa celular interna o el trofoectodermo de embriones preimplantados y sus núcleos son transferidos dentro de oocitos enucleados. Los individuos obtenidos son casi idénticos entre sí, aunque diferentes a los padres del embrión que aportó el núcleo transferido.  Se ha demostrado que la supervivencia de los clones formados a partir de células madre embrionarias en el instante del nacimiento o hasta la edad adulta, es 10 a 20 veces mayor que en los derivados de células somáticas.Por otra parte, los clones derivados de células madre embrionarias tienen mejores posibilidades de reactivar completamente genes claves para el desarrollo embrionario tales como oct4 y 10oct4 y así constituir una población de células verdaderamente totipotenciales. Sin embargo, las células madre embrionarias, aunque requieren un menor grado de reprogramación que las células somáticas, presentan una elevada inestabilidad epigenética en cultivos in vitro. 

 La inestabilidad se refleja en una expresión aberrante de la huella genética, de modo que, cuando estas células se utilizan como donantes para la clonación reproductiva, el fenotipo fetal y placentario de los clones, exhibe graves patrones de anormalidad. Sin embargo, cuando se emplean como fuente de núcleos para la clonación terapéutica, en apariencia no ocurre este error, pues, durante la reprogramación, se seleccionan tan sólo las células competentes.

Clonación celular: Clonar una célula consiste en formar un grupo de ellas a partir de una sola. En el caso de organismos unicelulares como bacterias y levaduras, este proceso es muy sencillo, y sólo requiere la inoculación de los productos adecuados.Sin embargo, en el caso de cultivos de células en organismos multicelulares, la clonación de las células es una tarea difícil, ya que estas células necesitan unas condiciones del medio muy específicas.

Una técnica útil de cultivo de tejidos utilizada para clonar distintos linajes de células es el uso de aros de clonación (cilindros).De acuerdo con esta técnica, una agrupación de células unicelulares que han sido expuestas a un agente mutagénico o a un medicamento utilizado para propiciar la selección se ponen en una alta dilución para crear colonias aisladas; cada una proviniendo de una sola célula potencialmente y clónicamente diferenciada.

 En una primera etapa de crecimiento, cuando las colonias tienen sólo unas pocas células; se sumergen aros estériles de poliestireno en grasa, y se ponen sobre una colonia individual junto con una pequeña cantidad de tripsina.Las células que se clonan, se recolectan dentro del aro y se llevan a un nuevo contenedor para que continúe su crecimiento.

Clonación molecular: La clonación molecular se refiere al proceso de aislar una secuencia de ADN de interés, insertarlo en un plásmido y obtener múltiples copias de ella en un organismo (generalmente procariota) por acción de la DNA polimerasa.

 La clonación se emplea frecuentemente para amplificar fragmentos de ADN que contienen genes, un paso esencial en el análisis subsecuente. Frecuentemente, el término clonación es erróneamente utilizado para referirse a la identificación de una localización cromosómica de un gen asociado con un fenotipo particular de interés, como en la clonación posicional. En la práctica, la localización de un gen en un cromosoma o región genómica no necesariamente habilita para aislar o amplificar la secuencia genómica de interés.

Bibliografia:
http://html.rincondelvago.com/clonacion_3.html
http://www.slideshare.net/ALEJANDRAJAIME/clonacion-5285149

4.2.2. ENZIMAS DE UNION


Inserción de los fragmentos de ADN. Esta inserción se realiza en vectores de clonado, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras.
Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras. 


Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus. de introducirlos en las células hospedadoras.

Plásmidos: Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación.


Bibliografía:
Apuntes de clases.

4.2. CORTE Y UNION DE MOLECULAS DE ADN 4.2.1. ENZIMAS DE CORTE


Enzimas de restricción: producción de fragmentos de DNA para recombinación
Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción fueron descubiertas por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans. Estas son enzimas sumamente específicas que catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en lugares específicos, creando de esta manera una serie de fragmentos. Se ha visto que ciertas cepas de E. coli degradan (cortan) el DNA de ciertos virus fagos infectivos, a menos que los ácidos nucleicos presenten metilación (adición de grupos metilo) en algunos residuos de adenina o citosina del sitio de corte.

La función de las enzimas de restricción es la proteger al organismo de DNA extraño. Cuando una porción de DNA foráneo ingresa a la célula, las enzimas de restricción se encargan de degradarlo cortándolo en pequeños fragmentos, siempre y cuando éste no esté modificado.

Actualmente se conocen unas 200 enzimas de restricción (las más conocidas se muestran en la tabla 1), las cuales se nombran de acuerdo al organismo del cual se extraen, como por ejemplo EcoRI y EcoRII, que se extraen de E. coli o HaeIII que se extrae de Haemophilusaegyptius.
Una característica de las enzimas de restricción es el reconocimiento de secuencias palindromicas.

Tabla. Algunas de las principales enzimas de restricción conocidas y su origen (en base a Griffiths et al. 1998).
Enzima de restricción
Organismo de donde se extrae
EcoRI
Escherichiacoli
EcoRII
Escherichiacoli
HindII
Haemophilusinfluenzae
HindII
Haemophilusinfluenzae
HaeIII
Haemophilusaegyptius
HpaII
Haemophilusparainfluenzae
PstI
Providencia stuartii
Mayi
Serratiamarcesens
BamI
Bacillus amyloliquefaciens
BglII
Bacillusglobiggi






Las enzimas de restricción trabajan únicamente sobre secuencias específicas de bases nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de restricción y producen dos tipos de corte:
(1) corte con extremos cohesivos y

(2) corte con extremos romos (ver Fig. ) (Griffiths et al. 1998).

Los extremos cohesivos dejan porciones lineales a ambos lados del fragmento, es decir, quedan pequeñas secuencias de bases sin aparear a cada lado, siendo éstas complementarias entre sí, mientras que los extremos romos son aquellos en los que no queda una porción lineal a ninguno de los lados.

De acuerdo a la especificidad de las enzimas de restricción, se conocen dos tipos:
  1. -las enzimas de tipo I cortan en un sitio cercano al sitio de restricción, a una distancia que varía aleatoriamente, y por ello no se suelen emplear para DNA recombínate.
  2. -Las de tipo II reconocen y cortan en la secuencia específica, y son las más empleadas en este tipo de protocolos por su alta precisión.
  3. -Las enzimas de restricción de tipo III son similares a las de tipo II en cuanto a la precisión del lugar de corte, pero se diferencian de éstas en que sólo cortan entre nucleótidos del mismo tipo, por ejemplo entre dos adeninas.Algunas enzimas de restricción como EcoRV encuentran el sitio de restricción, por medio de un barrido a lo largo del surco mayor del DNA y reconocen una secuencia palindrómica de seis nucleótidos de longitud, en la que se presenta una simetría rotacional binaria. Cuando la enzima de restricción encuentra el sitio de corte, se producen una serie de reordenamientos estructurales en el DNA y se produce un ajuste inducido en el cual el DNA sufre una torsión de 50 grados. En este proceso se va haciendo un barrido muy rápido sobre la hebra de DNA, leyendo grupos de seis nucleótidos, hasta encontrar la secuencia diana. Esto comprueba el carácter altamente específico de las enzimas de restricción.

Los puntos de corte de las enzimas de restricción pueden ser empleados como marcadores para la elaboración de mapas de restricción. Para elaborar un mapa de restricción, se tiñen los fragmentos resultantes de la lisis y se los separa mediante una electroforesis PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida) y se establecen las distancias de migración, siendo los resultados muy específicos para cada molécula de DNA en estudio.
Los extremos cohesivos son los más empleados en la construcción de DNA recombinante, puesto que al tener una porción lineal "pegajosa" es más sencillo que se produzca la unión con el DNA del hospedero, por complementación de bases, dicha unión se produce por la intervención de enzimas denominadas ligasas. Adicionalmente, la enzima transferasa terminal puede ser usada para generar extremos cohesivos en un fragmento de DNA. A pesar de ser más difícil, también es posible realizar uniones de extremos romos, mediante la adición de conectores sintéticos de DNA que actúan a manera de extremos cohesivos (como el caso de la transferasa terminal), sin embargo este procedimiento no es de mucha utilidad para realizar una clonación directa de DNA.

Existe otro tipo de enzimas de restricción de doble función, denominadas endo–exonucleasas, las cuales son capaces tanto de añadir nucleótidos como de removerlos de una hebra de DNA. Estas enzimas también son muy específicas y reconocen secuencias exactas, plantea que las enzimas de restricción del tipo endo–exonucleasas pueden tener un papel fundamental en la reparación del DNA y/o en la muerte de células defectuosas, gracias a la especificidad de la enzima. Se han hecho numerosos experimentos con endo–exonucleasas aisladas de E. coli, Neurosporacrassa, Aspergillus nidulans, mitocondrias de Saccharomycescerevisiae, Drosophila melanogaster, células de mono y células leucémicas de humano.


 Bibliografía:
Apuntes de clases.


4.1. TRASFORMACION DE ORGANISMOS

La tecnología del DNA recombínate es una técnica que ha permitido introducir material genético foráneo en un individuo, y hacer que éste organismo incorpore dicho material a su genoma y lo exprese como si fuera suyo. Esta tecnología desarrolló a partir del descubrimiento de las enzimas de y su acción sobre los ácidos nucleicos.

La recombinación genética es un proceso biológico que se produce normalmente en todos los organismos, tras el cual se produce un cambio del genoma (patrimonio genético del que está dotado un organismo) y se verifica normalmente con la rotura y la reunión del ADN. Hoy es posible crear moléculas recombinantes entre segmentos de ADN que no presentan homología y que pueden proceder de organismos diversos. Con el uso coordinado de las enzimas de restricción y de los vectores moleculares, es posible aislar una secuencia de ADN de cualquier organismo e inserirla en el ADN de otro. Las formas vivas que han sufrido tal transformación y que contienen un ADN extraño son llamadas transgénicas. Es quizás necesario abrir un paréntesis para aclarar el hecho de que la clonación. de la oveja Dolly no se ha obtenido con técnicas de ingeniería genética. Dolly es solamente un gemelo idéntico, como los que se observan en la naturaleza, aunque estos últimos son "más" idénticos en cuanto que comparten también el material genético contenido en las mitocondrias . Las técnicas de clonación que permiten obtener gemelos idénticos consisten en sustituir el núcleo de la célula madre por un núcleo de un donante del cual se quiere hacer una copia. 

La célula obtenida de este modo dará origen a un embrión cuyas mitocondrias contendrán el ADN de la célula madre y no el contenido en las mitocondrias del organismo del cual se ha querido hacer la copia. En caso de gemelos idénticos obtenidos naturalmente, los dos individuos comparten todo el patrimonio genético incluido el mitocondrial. Cerrado este paréntesis necesario para subrayar la diferencia entre ingeniería genética y clonación, en la que no se manipula el ADN y no se interviene en el orden genético de los organismos, pasamos a describir los vectores moleculares necesarios para las operaciones de ingeniería genética.

Bibliografía:
http://www.ivu.org/spanish/trans/ssnv-genetic.html