martes, 30 de octubre de 2012

2.3.7.4. MANEJO DEL MATERIAL TRASPLANTADO

Manejo de las plantas después del transplante inicial

Con la utilización de métodos, como el de Sistema de Inmersión Temporal, ahora es posible producir un número muy grande de plantas, en períodos cortos de tiempo, por lo que existe la necesidad de generar metodologías de manejo que permitan recuperar y mantener las plantas en buenas condiciones hasta que son llevadas al campo. 

Esta fase empieza a partir del momento en que las plantas, debidamente acondicionadas, son colocadas en la casa de malla. A partir de allí, los pasos sugeridos son los siguientes: 

a. Al octavo día de tener las plantas en la casa de malla se retira el amarre de la bolsa plástica, permitiendo a las plántulas que se vayan adaptando al micro ambiente de las instalaciones. 
b. Riego: Si las condiciones son normales y no hay marchites fisiológica, se hace el segundo riego de mantenimiento a los 10 ó 12 días después del transplante. Este segundo riego (10 cm3 por planta) va acompañado con una mezcla de fertilizante rico en fósforo para continuar estimulando el desarrollo de las raíces. Dependiendo de las condiciones micro-climáticas que se tienen en la casa de malla y del estado de turgencia de las plántulas, se puede programar uno o dos riegos diariamente. 
c. Riego automático en casa de malla: Cuando el número de plantas sobrepasa las 1.500, se justifica el riego por microaspersión, que debe estar controlado por un reloj y una válvula solenoide. Cuando se utiliza este sistema de riego se deben realizar inspecciones rigurosas para detectar cualquier problema fitopatológico. 
d. Fertilización: Cada ocho días se realiza la fertilización con un abono rico en fósforo, alternándolo con un fertilizante completo que contenga los elementos mayores y menores. Si se presentan síntomas puntuales de la deficiencia de un elemento se puede realizar una fertilización foliar con fertilizantes simples o completos. 
e. Segundo transplante: Cuando las plántulas tengan entre 45 y 60 días del primer transplante es necesario realizar un nuevo transplante a bolsas plásticas con una capacidad de 500 gramos de suelo, en el que se puede adicionar micorrizas, si se considera necesario, según los análisis del suelo en el que las plantas van a ser sembradas definitivamente. 
f. Transplante al sitio definitivo: Entre los 2 y 3 meses de permanecer en la casa de malla, las plantas están listas para ser llevadas al sitio definitivo. Durante este período es importante estar atento a deficiencias nutricionales o problemas de plagas y enfermedades. 

Bibliografia

2.3.7.3. TRASPLANTE Y ADAPTACION BAJO CONDICIONES DE INVERNADERO

Antes de transplantar, se elimina completamente el medio de cultivo de las raíces, para ello se colocaran las plántulas en un recipiente con agua limpia y el medio se eliminara de las raíces manualmente sin dañar a las plántulas. Con la finalidad de evitar contaminación por enfermedades fungosas, las plántulas se sumer durante cinco minutos en un recipiente que contenga una solución preparada con fungicida. Para el trasplante se utiliza un sustrato el cual se esteriliza.
La eficiencia del proceso de adaptación depende, entre otros factores, de la elección del sustrato y de la obtención de una relación adecuada entre los componentes de la mezcla, que asegure una buena supervivencia en el transplante. Dicho sustrato deberá permitir la formación de un pan de tierra con una buena estructura. Se trata de materiales sólidos y porosos, de origen natural o sintético, que solos o en mezclas, permiten un crecimiento adecuado de las plantas en condiciones controladas (Abad,1989).


Bibliografía:

2.3.7.2. DESINFECCION O ESTERILIZACION DEL SUSTRATO

Técnicas físicas: Estas técnicas están basadas en la utilización del calor como esterilizante, en sus diferentes formas de aplicación, como son la desinfección por calor y la solarización.

Desinfección del suelo con productos químicos: Esta técnica esta basada en el empleo de los distintos productos químicos y mediante los efectos de los mismos lograr la desinfección del suelo.

Desinfección con vapor de agua:Es un método de desinfección del suelo en el que se emplea el vapor de agua como desinfectante de todos los parásitos existentes en el suelo. Dicho vapor se obtiene de una caldera móvil generalmente a 80 - 100ºC que mediante una serie de tuberías y tubos es conducida al suelo donde va desinfectándolo poco a poco a una profundidad variable (5 - 15 cm) según el sistema utilizado, y con una duración media del tratamiento comprendida entre 5 y 20 minutos

Pero el efecto de este vapor también puede ser negativo ya que si se aplica a una profundidad demasiado elevada puede destruir las bacterias nitrificantes del suelo.
La efectividad del sistema es mucho mayor en suelos secos que húmedos por lo que será aconsejable que evitar aplicar riegos antes de efectuar el tratamiento.
La desinfección con vapor de agua es un método con una efectividad alta y su principal inconveniente es su alto costo.
Las desinfección por vapor de agua presenta ventajas e inconvenientes, como son:
Cuando se emplea este método, las bacterias amonificantes suelen ser destruidas por lo que se suele producir una elevación en el contenido en amoniaco del suelo, por lo que pueden producirse fitotoxicidades por una excesiva acumulación amoniacal.
De lo contrario cuando se realiza la desinfección con calor determinados elementos minerales pasan a formas mas asimilables por la planta, lo que en terrenos muy ricos pueden llegar a ocasionar riegos de salinidad.

Bibliografia:

2.3.7.1. TIPOS DE SUSTRATO

Un aspecto importante a tener en cuenta lo constituye la elección del substrato, siendo el adecuado aquel que permita el normal crecimiento y desarrollo de las raíces. Se puede emplear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mezclas de ellos, teniendo la precaución de realizar una esterilización previa. Es conveniente el agregado de fertilizantes, sea a través del substrato (fertilizantes de liberación controlada) o bien mediante el sistema de riego (fertilizantes solubles); empleándose proporciones ricas en fósforo (N-P-K: 9-45-15) y potasio (N-P-K: 4-25-35) que favorecerán el desarrollo radicular y la rustificación de las plantas.


Bibliografia:
http://www.argenbio.org/adc/uploads/Libro_INTA_II/Parte_I.pdf

2.3.7. TRASPLANTE AL SUSTRATO

Consiste en realizar el trasplante del medio de cultivo a un sustrato para su maduración. Si el sistema radical fue diferenciado in vitro las plantas no se pueden trasplantar directamente a las condiciones de invernadero sin una paulatina adaptación a las condiciones de suelo. A este periodo de adaptación se le ha denominado periodo de endurecimiento. 

Con especies leñosas, anuales y suculentas, las plantas obtenidas in vitro se deben lavar cuidadosamente para eliminar todos los residuos de agar, que puedan ser una fuente de contaminación. Posteriormente, se trasplantan a recipientes con suelo estéril y se cubren con bolsas de polietileno, que van perforando gradualmente hasta que queden eliminadas completamente en un periodo de 15 a 20; esto se hace con el objetivo de adaptar paulatinamente las plantas a las condiciones de invernadero. Durante esta fase de endurecimiento las plantas se riegan preferentemente con medio de cultivo diluido al 50% y posteriormente se sustituye esta formula de riego por soluciones nutritivas menos complejas.
 
Bibliografia 

2.3.6.4. PREADAPTACION Y TRASPLANTE

Pre-adaptación de plántulas:
En algunas ocasiones, el número de plantas recibidas de una sola vez fue muy alto y la capacidad disponible de mano de obra no permitió una manipulación rápida del material, debiendo permanecer varios días en las cajas. En estas condiciones se observó una tasa de mortalidad alta. Cuando esto sucede, se recomienda guardar los frascos en un lugar fresco y con luz adecuada, durante 1 ó 2 días. En este período se retira la cinta plástica que rodea la tapa de los frascos para aclimatar la plántula a las condiciones del lugar. Se aconseja que todo el proceso del transplante se inicie a partir de las 4:00 p.m., todos los días, con el fin de evitar la deshidratación de las plántulas, especialmente si el trabajo se realiza en una casa de malla.

Substrato para el transplante:
Los mejores resultados que se obtuvieron en el proyecto, en cuanto al sustrato a usar para el endurecimiento, fueron con la mezcla de 1 parte de suelo molido o zarandeado (capa arable no arcillosa) y tres partes de arena (arena gruesa lavada).

Bibliografía:
http://www.sian.info.ve/porcinos/eventos/clayuca0102/fenavi.htm

2.3.6.3. ENRAIZAMIENTO

El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de reguladores de crecimiento o que sólo contenga auxinas. Esta operación se realiza en condiciones de esterilidad (en cabina de flujo). En el segundo caso los brotes se sumergen en una solución concentrada de auxinas y se transfieren a un sustrato limpio, no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Los brotes que se utilicen en el enraizamiento ex vitro deben ser vigorosos y poseer hojas bien desarrolladas, ya que las plantas deben realizar la fotosíntesis para obtener la energía necesaria para desarrollarse y formar las raíces. 


“La inducción de estas raíces se produce modificando ligeramente las características del medio de cultivo adecuándolas para la generación de raíces.” 


BIBLIOGRAFÍA 
http://www.bonsai-flora.es/invitro.htm
Silvia Radice. 2010. En: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II, PDF Argenbio, INTA. pags.: 26-33

2.3.6.2. CRECIMIENTO DE YEMAS ADVENTICIAS

La iniciación directa principia con células de parenquima que están situadas ya sea en la epidermis o justo abajo de la superficie del tallo; algunas de esas células se vuelve meristemoides las cuales aparentemente se originan de células individuales, sin embargo, la respuesta de los explantes depende de la concentración de hormonas El desarrollo indirecto de brotes adventicios implica, primero la iniciación de callo basal de los brotes separados en cultivos, Los brotes se originan en la periferia del callo e inicialmente no están conectados al tejido vascular del explante, de manera similar, en plantas intactas, si se aplica citoquinina en bloques de agar cilíndrico pueden originarse de brotes del callo formado en el ápice de epicotilos decapitados.

Iniciacion de los brotes

Se pueden iniciar nuevos ápices de ramas o brotes ya sea:
  • Directamente del explante
  • Indirectamente del callo que se forma en la superficie cortada del explante.

Los dos factores más importantes que afectan la iniciación de brotes adventicios son:
  • La relación del explante
  • El régimen de hormonas que se suministran a las plantas.
Bibliografía:
http://www.google.com.mx/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=9&cad=rja&ved=0CFcQFjAI&url=http%3A%2F%2Fwww.lamolina.edu.pe%2Fagronomia%2Fdhorticultura%2Fhtml%2Fpropagacion%2Ffitohormonas%2Fshuamanyauri.doc&ei=E5uMUJnFIcygqQHI1oCgBw&usg=AFQjCNEzB_pIJA0zWl8nAyQxzGVB6wFsog&sig2=dW4aiX5MiBKV2OwN0kLAYQ

2.3.6.1. FORMACION DE CALLO

La composición salina más empleada para inducir la formación de callo, la organogénesis directa o indirecta en la mayoría de las especies vegetales, es la de Murashige & Skoog (1962) (MS). Sin embargo, existen otras formulaciones diseñadas para inducir determinados patrones morfogénicos. Existe, además, una estrecha relación entre la composición hormonal del explante y la concentración de reguladores del crecimiento agregada al medio de cultivo.

Bibliografia

2.3.6. CAMBIOS FISIOLOGICOS DEL EXPLANTE


Los cambios fisiológicos dependen mucho de las condiciones en que se encuentre la planta, y se expresa como un cambio de comportamiento ocasionado por las condiciones de cultivo; estos cambios ocurren con frecuencia, y son revestidos cuando el cultivo se vuelve a poner en las condiciones originales, algunos de los cambios que sufren las plantas al ser sometidas a diferentes condicion son:
  • La cuticula es mas delgada
  • Como tienen mucha humedad relativa las raíces son más delgadas, pocas raíces y no son funcionales.
  • Estomas atrofiados, no son funcionales al 100%.
  • Cutícula más delgada y con aberturas
  • Con menos luz y azúcar en las plantas se realiza menos fotosíntesis y en gran porcentaje son heterótrofas y en poco porcentaje son autótrofas.
  • Parénquima desorganizado, no están unidas, es decir, es ineficiente.
Bibliografía:
apuntes tomados en clase

2.3.5.4. HUMEDAD RELATIVA

La humedad relativa (HR) como medida de la cantidad de vapor de agua contenida en la atmósfera gaseosa, es otro de los parámetros físicos a tener en cuenta. La HR dependerá del sello o cobertura del envase empleado. Si este cierre es hermético, la humedad interior será del 100 %. Si existe la posibilidad de un intercambio gaseoso, la humedad interna puede descender a niveles cercanos al 50 %. Este importante descenso del contenido de HR puede promover una pérdida veloz de agua del medio de cultivo, variando la concentración de sus compuestos hasta llegar a niveles tóxicos.

Bibliografia

2.3.5.3. TEMPERATURA

La temperatura de incubación de los cultivos es un factor importante a tener en cuenta. Si bien en condiciones naturales las plantas experimentan diferencias térmicas durante el día y la noche, las temperaturas in vitro se mantienen casi estables. Es importante señalar que cuanto más se asemejen las condiciones in vitro a las óptimas de crecimiento de la especie estudiada, mayor será la respuesta obtenida. En cultivos de hojas de Streptocarpus x hybridus sometidos a diferentes temperaturas se observó que la regeneración mayor de brotes se producía a 12 ºC mientras que por encima de los 30 ºC, prácticamente no se observó diferenciación.


Bibliografia:

http://www.argenbio.org/adc/uploads/Libro_INTA_II/Parte_I.pdf

2.3.5.2. INTENSIDAD LUMINICA

la opción más económica es el empleo de la luz natural, disminuyendo su irradiancia (20-50%) mediante el agregado de mallas de sombreado («saram»). No obstante, en aquellas latitudes donde el nivel medio de luz natural es bajo y los días son cortos durante una parte considerable del año, la luz artificial puede ser aplicada como complemento de la luz natural. Las lámparas tubulares fluorescentes del tipo «luz día» son empleadas en horticultura para prolongar el fotoperíodo. Asimismo, las lámparas tubulares de sodio alta presión presentan una distribución espectral de la energía adecuada para estimular fotosíntesis y se emplean para tal fin en una amplia variedad de cultivos. La luz suministrada a los cultivos debe ser evaluada en cuanto a la calidad, intensidad y período de suministro. La respuesta morfogé-nica de un explante puede variar según si se le proporciona luz o no. Para estimular la formación de callo, es común que se prefiera la oscuridad. El suministro de luz favorece la diferenciación de órganos.

Bibliofrafía:
http://www.argenbio.org/adc/uploads/Libro_INTA_II/Parte_I.pdf

2.3.5.1. FOTOPERIODO

Podemos definir el fotoperíodo como el conjunto de los procesos mediante los cuales muchos organismos y vegetales regulan sus funciones biológicas como puede ser el caso del crecimiento o la reproducción, utilizando como indicador la alternancia día-noche de los diversos días del año, donde encontramos días de larga duración y días de menor duración dependiendo de la estación del año y por lo tanto del ciclo del sol.


La alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad: El fotoperiodo: Algunos fenómenos propios del desarrollo de las plantas (germinación, floración, tuberización, etc.) pueden ser activados por el número de horas diarias de luz que recibe la planta.
De forma análoga, el número de horas de luz que recibe el explante cultivado in vitro puede afectar a su desarrollo. En general, el mejor fotoperiodo in vivo será también el mejor fotoperiodo in vitro.

Bibliografia
bd.unsl.edu.ar/download.php?id=1032. PDF. "Cultivo in vitro de tejidos vegetales. Aplicaciones Biotecnológicas"

2.3.5. CONDICIONES DE INCUBACION


Condiciones de incubación Iluminación: 

  • Composición espectral
  • Irradiancia
  • Fotoperíodo
  • Temperatura Humedad 
  • Disponibilidad de agua 
  • Ventilación Otros
  • Distintos recipientes de cultivo y sistemas de ventilación
  • Cultivo en biorreactores
  • Condiciones de incubación Cultivo en biorreactores
  • Condiciones de incubación Cultivos “vitropónicos”
  •  Condiciones de incubación Cultivo en bolsas plásticas
Bibliogrofía:

sábado, 27 de octubre de 2012

2.3.4.3. SIEMBRA DE DIFERENTES MEDIOS : SOLIDOS Y LIQUIDOS


Medios de cultivo: Sólido y Líquido
Una forma muy útil de poder aislar, identificar y conservar los microorganismos es mediante el uso de medios de cultivo, inicialmente ideados por Pasteur (que como ya sabemos se considera el padre de la microbiología), quien se dio cuenta que los microorganismos podían crecer en soluciones que tuvieran azúcar y una fuente de nitrógeno.

De ese tiempo hasta acá, ha pasado mucha agua debajo del puente y actualmente existen medios muy especializados para microorganismos muy exigentes. La forma más sencilla de clasificar los medios de cultivo es por su consistencia…entonces aparecen los medios de cultivo sólidos y los medios de cultivo líquidos o también llamados caldos. En ambos medios debe haber una buena cantidad de nutrientes que faciliten el crecimiento bacteriano… y entonces cual es la diferencia?….pues la diferencia radica en la presencia de una sustancia que se llama Agar o “Agar-Agar” y que es la encargada de darle la solidez y consistencia al medio. Esta sustancia proviene, principalmente, de un alga llamada Gelidium, aunque muchos otros géneros pueden servir como fuente de este polisacárido (es decir, un azúcar grande formado por la unión de azúcares pequeños). Y como se obtiene del alga?…Se toman sus semillas, se lavan, se secan, se realizan procesos de extracción, filtración, purificación y desecación para que queden hojuelas o polvo y luego si adicionarla al medio de cultivo.

Fue, Robert Koch, médico alemán dedicado al estudio de los microorganismos y considerado uno de los autores de la “teoría microbiana”, quien empezó a cultivar y aislar microorganismos. Koch, buscando mejorar la técnica utilizada hasta ese momento, decidió solidificar los medios de cultivo añadiéndoles gelatina. Sin embargo, y a sugerencia de una ayudante, introdujo el agar.

Bibliografía:

2.3.4.2. DISECCION DEL EXPLANTE


DISECCION DEL EXPLANTE

Bibliofrafía:

2.3.4.1. DESINFECCION DEL EXPLANTE

DESINFECCION
Los explantos deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo

 CRITERIOS PARA LA DESINFECCION DE LOS EXPLANTES

Lavado con agua corriente durante 20-30min
Etanol 70%, entre 5 y 10 seg.
Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) de 5 a 20%, entre 5 y 30 min. Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%. soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2 ), entre el 0,01 y 0,05%.
Enjuagues con abundante H2O estéril (4 ó 5 veces).
En el caso del HgCl2 , el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difícil de eliminar.

Bibliografía:

2.3.4. SIEMBRA DEL EXPLANTE

Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante (Fontúrbel 2001) y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo (Kyte & Kleyn 1996). 

Los explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un medio de cultivo apropiado (Kyte & Kleyn 1996) al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante está en el medio, se sella el rasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo. 

Una vez que los explantes –luego de algunas semanas en la cámara de crecimiento– han desarrollado algunas raíces y hojas, es el momento de realizar el traspaso al invernadero. Este es uno de los pasos más difíciles de la técnica, ya que los explantesin vitro se encuentran en condiciones ambientales muy diferentes y se alimentan de manera heterotrófica (del medio de cultivo) y el estrés de adaptación a las condiciones de vivero es muy fuerte (Kyte & Kleyn 1996, Fossard 1999). Un porcentaje de las plántulas clonadas in vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si sobrevive crece –ya en condiciones normales– y al cabo de una semanas está lista para ser trasladada al campo de cultivo.

Bibliografía:

2.3.3.3. TAMAÑO DEL EXPLANTE


Tamaño: 

En general, cuanto más grande sea el explante mayores serán las posibilidades de inducir la proliferación de callos o la regeneración directa de órganos. Sin embargo, a mayor tamaño de explante también son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con microorganismos. También es necesario tener en cuenta que existe un tamaño mínimo del explante, que depende de la especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fácil lograr el establecimiento de los cultivos. Los explantes muy pequeños suelen requerir del empleo de medios más complejos o de los denominados medios acondicionados.

Bibliografía:

2.3.3.2. POSICION DEL EXPLANTE EN LA PLANTA

En algunas plantas cualquier segmento de un órgano cualquiera tienen aproximadamente la misma capacidad regenerativa. Si existen diferencias, pueden ser explicadas generalmente por el hecho de que en la hoja (o tallo), hay tejidos de diferentes edades. Por otro lado, también se han encontrado grandes diferencias, según las zonas, en capacidad de regeneración de algunos órganos.

Bibliografía:

2.3.3.1. TIPOS DE EXPLANTE


Tipos de cultivos de tejidos. 

Se podría hablar de tres tipos de cultivos: 

Cultivo de órganos. Implica que la arquitectura característica del tejido “in vivo” se mantiene al menos en parte. Para ello el órgano se mantiene en un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos y en el que mantiene su estructura tridimensional, en general esférica. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados y es por ello una buena réplica del tejido de origen, pero por el contrario no permite su propagación pues el crecimiento, de producirse, se limita a la periferia y es debido fundamentalmente a los tipos celulares embrionarios. La imposibilidad de propagar obliga a partir en cada nuevo experimento de nuevo material animal lo que conlleva una elevada heterogeneidad. 

Explantes primarios. Fragmentos de tejidos o de órganos que se adhieren a una superficie y en la que proliferan las células de la periferia del explante. 

Cultivo celular. Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o mecánicos. La suspensión celular se puede cultivar como una monocapa adherente o en suspensión en el medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite su propagación, aumentando notablemente la 

masa celular del cultivo a lo largo de las generaciones. Como característica negativa se pierde la heterogeneidad celular de partida, la población se hace uniforme y homogénea al predominar en el cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento.

Bibliografía:

. 2.3.3. EXPLANTE

Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas (Fossard 1999). El tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagación depende de la especie con la que se esté trabajando y de los objetivos que se persigan. Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo. Otros explantes como las yemas adventicias son mas bien genéticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es útil para la producción de plántulas con una determinada característica de cultivo, pero si lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de cultivo.         

bibliografia:

2.3.2.5. EDAD DEL ORGANO O TEJIDO VEGETAL

  • Edad del órgano o de la planta que ha sido extraida: es la edad biológica de la planta, es el tiempo que transcurrió desde que la planta comenzó como retoño o como embrión.
  • Edad fisiológica o ontogenetica o fase de crecimiento: incluye los conceptos de juvenilidad y adulto.
  • El grado de diferenciación: con este concepto, las partes más jóvenes de la planta son células meristematicas no diferenciadas. Teóricamente se dice que algunas plantas poseen las células meristematicas siempre en estado juvenil y que podrían vivir para 
    siempre.
    Periodo de cultivo: es el tiempo desde que recién se instala el cultivo.


    Bibliografia:
l

2.3.2.4. CONDICIONES DE CRECIMIENTO DE LA PLANTA


Los cultivos de tejidos vegetales deben mantenerse en condiciones ambientales semejantes a las naturales más favorables. La luz, la temperatura y la humedad relativa son los principales factores del ambiente que inciden sobre los cultivos (Vidalie, 1986). El comportamiento de muchos cultivos depende de la calidad, intensidad y fotoperíodo de la luz que reciben, dado que varias enzimas involucradas en el desarrollo y en el metabolismo secundario son influenciadas por la luz. La mayoría de los cultivos desarrollan a una intensidad luminosa entre 5 a 25 W/m2 (1000 a 5000 lux). Si bien la calidad de la luz puede determinar diferentes respuestas morfogénicas, en general se utiliza luz blanca, pobre en longitudes de onda larga. El fotoperíodo habitualmente utilizado es de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, aunque algunos cultivos requieren oscuridad (Marín, 1993). 
La temperatura de las cámaras de cultivo se regula en general entre 22 y 28°C, permitiendo así el desarrollo tanto de especies de climas templados como de plantas tropicales. Es de destacar que durante el período iluminado, la temperatura en el interior de los frascos de cultivo es 1-2°C superior a la de la cámara, debido al efecto invernadero;  se crea así un termoperíodo suave (Marín, 1993).  La velocidad de síntesis y de degradación de distintos compuestos y por ende el nivel de producción y acumulación de metabolitos también es influenciado por la 4.- Cultivo in vitro     38 temperatura. Así, Nicotiana tabacum acumula entre un 100 a 200 % más nicotina a 27°C que a 21°C o a 31°C (Mantell & Smith, 1983).  En cuanto a la humedad relativa, ésta se mantiene en alrededor del 70 % en las condiciones en las que se realizan habitualmente los cultivos, aunque varía con la temperatura de la cámara y el tipo y cierre de los recipientes. El porcentaje de humedad relativa no es reportado en la mayoría de los trabajos sobre cultivo in vitro de vegetales (George, 1987a).

Bibliografía:

2.3.2.3. EDAD DE LA PLANTA


La edad es un factor importante ya que los tejidos juveniles poseen un alto grado de actividad meristematica y tienden a tener mas plasticidad in vitro que los adultos, como es el caso de la respuesta de cotiledones, hipocótilos y hojas aisladas de material juvenil que son usadas para micropropagacion. Los tejidos juveniles presentan una mayor capacidad morfogenetica, la cual se manifiesta en respuesta de crecimiento, proliferación y enraizamiento, a diferencia de un tejido maduro el cual es mas difícil de desdiferenciar e inducir a la producción de raíces y brotes.
La edad de la planta y el grado de diferenciación del tejido, muchas veces son están interrelacionados, y pueden producir efectos interactivos cundo se cultiva in vitro.

Bibliografía:

2.3.2.2. FITOSANIDAD


Es muy común la utilización del cultivo de tejidos para la obtención de plantas libres de virus. El explante ideal para ello es el meristema (dependiendo de la especie, de 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y de un par de primordios foliares. La planta que se va a utilizar para la propagacion in vitro deben de encontrarse libres de plagas virus o enfermedades para asi obtener plantas sanas. ademas de que se deben buscar plantas que se encuentren en estado vegetativo .

Para evitar y/o minimizar las contaminaciones de los cultivos con microorganismos es necesario:

  •  Conocer el material vegetal con que se trabaja y los posibles contaminantes especí- ficos.
  •  Realizar una adecuada preparación de la planta dadora de explantes, cultivándola preferentemente en invernaderos tratadas con productos químicos que eliminen patógenos y eventuales microorganismos endófitos.
  •  Proceder a la desinfección superficial de los explantes mediante el uso de compuestos químicos con el objeto de eliminar los microorganismos con el menor daño posible para el explante. Si bien no es posible recomendar un procedimiento general, se puede señalar que el procedimiento más popularizado consiste en una doble desinfección mediante la inmersión de los explantes en etanol (70%v/v) durante 20-60 segundos seguido de hipoclorito de sodio 1 -3%, contenido en el agua de lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos, dependiendo de la naturaleza del explante. 
Bibliografía:

2.3.2.1. GENOTIPO

Es uno de los factores más influyentes en la regeneración in vitro ya que, existen grandes diferencias en la división celular y la capacidad regenerativa en plantas provenientes de una misma especie, como lo observa SWARTZ (1991), quien considera que la respuesta morfogenética de los brotes regenerados, está fuertemente influenciada por el genotipo, ya que algunos explantes provenientes de diferentes individuos parentales presentaban una variación en su desarrollo con las mismas concentraciones hormonales.

Bibliografía:

http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis48.pdf

2.3.2. SELECCION DE PLANTAS MADRE



Las plantas madres son aquellas de las cuales se obtienen material vegetativo para ser empleado en la siembra Pueden ser plantas en producción de pimienta en parcelas de agricultores o plantas preparadas exclusivamente para producir dicho material.

Para que una planta sea seleccionada como planta madre, según Andújar y Moya (2009) debe reunir las siguientes condiciones:

Tener un buen desarrollo.
• Poseer una forma columnar o recta.
• Debe ser una planta altamente productiva.
• Ser tolerante a enfermedades.
• Estar sana.
• No tener plantas enfermas a su alrededor

Bibliografía:

2.3.1.4. ADAPTACION


Adaptación:
 es el paso de aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones del ambiente usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo o algún sustrato inerte.

El enraizamiento ex vitro permite que la fase de enraizamiento y la fase de aclimatación se logren simultáneamente y que raramente se forme callo en la base de los explantos, asegurando así una conexión vascular, continua entre el vástago y la raíz.


ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS

Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantes o plantines enraizados de los frascos,  están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han  enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación  del explante. Por otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la perdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta.


Bibliografía:
http://www.inia.org.uy/publicaciones/documentos/lb/ad/2004/ad_382.pdf
http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_de_tejidos_vegetales

2.3.1.3. ENRAIZAMIENTO

Enraizamiento:
Es el proceso de inducción de la formación de raíces con el fin de convertir alos brotes o embriones somáticos en plántulas completas. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de reguladores de crecimiento o que sólo contenga auxinas. Esta operación se realiza en condiciones de esterilidad (en cabina de flujo). En el segundo caso los brotes se sumergen en una solución concentrada de auxinas y se transfieren a un sustrato limpio, no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Los brotes que se utilicen en el enraizamiento ex vitro deben ser vigorosos y poseer hojas bien desarrolladas, ya que las plantas deben realizar la fotosíntesis para obtener la energía necesaria para desarrollarse y formar las raíces.

ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS
 Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un tamaño aproximado  de 2 centímetros. Los  brotes obtenidos durante la fase de multiplicación  se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo  contenga hormonas del tipo auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea.

Bibliografía:
http://www.inia.org.uy/publicaciones/documentos/lb/ad/2004/ad_382.pdf
http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_de_tejidos_vegetales

2.3.1.2. MULTIPLICACION


Multiplicación: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.

Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron la FASE 1 y 2 originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada repique o división de las plantas. 


El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía de la micropropagación permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados. 
Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron la FASE 1 y 2 originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada repique o división de las plantas. 

El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía de la micropropagación permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados.

Bibliografía:

2.3.1.1. ESTABLECIMIENTO ASEPTICO



El establecimiento aséptico de tejidos vegetales, tiene como propósito determinado:

• Limpieza de virus y otros patógenos.

• Multiplicación clonal masiva.

• Resistencia a plagas y enfermedades.

• Resistencia a la toxicidad y otras condiciones ambientales adversas.

• Intercambio y la conservación de germoplasma.
Mayor producción por hectárea.

Bibliografía:

2.3.1. ETAPAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS

  1. ELECCIÓN de la planta y/o tejido donante de explantos.
  2. ESTABLECIMIENTO, que consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático según se desee. 
  3. MULTIPLICACIÓN: para generar una masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.
  4. ENRAIZAMIENTO: en la que se busca la formación de raíces con el fin de convertir los brotes o embriones somáticos en plántulas completas.
  5. RUSTICACIÓN : que es la aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones ambientales ex vitro (suelo o algún sustrato inerte).
Bibliografía:

2.3. ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE TEJIDOS


La biotecnología vegetal hace posible que los proyectos agropecuarios tengan mas realce y despunte a la hora de ejecutarlos, ahora vamos a entender sobre el establecimiento del cultivo de tejidos vegetales in vitro.

El termino cultivo de tejidos es muy amplio y tiene numerosos objetivos, dependiendo de la orientación que se quiera dar al laboratorio. La técnica de cultivo de tejidos in vitro es muy heterogénea mediante las cuales un explante, que no es mas que la parte separada de un vegetal, por ejemplo un trozo de hoja, tejido, etc., se cultiva asépticamente en un medio de composición química definida, para luego incubarla en a condiciones ambientales controladas.

La separación del explante y las operaciones relacionadas con su incubación in vitro, dependerá en gran medida del tipo de explante y del sistema de cultivo in vitro que se emplee, basándose desde luego en los objetivos que se persigan. Para el establecimiento de cultivo de tejidos, se deben analizar aspectos importantes tales como: el explante, la sepsia, los medios de cultivo y las condiciones ambientales de incubación.

EL EXPLANTE
Durante el proceso de establecimiento de cultivo de tejidos, la selección del explante apropiado constituye el primer paso a tomar. Esta elección se basa en el objetivo perseguido y la especie vegetal a usar.

El explante es la parte de la planta a partir del cual se inicia el cultivo.

Dependiendo de la especie y si las condiciones ambientales que se proporcionan al explante son adecuados uno de ellos podría proporcionar cienos de plantas. El tamaño del explante varía desde los 0.1 mm hasta piezas de tallo de 5 cm o más. Los explantes pueden ser meristemos, puntas de brotes, tallos, anteras, flores, hojas, embriones, semillas, raíces y yemas.

Si en el laboratorio se planifica obtener plantas provenientes de callos, los explantes obtenidos anteriormente son muy útiles, ya que cualquier explante con células nucleares son muy útiles para obtener callos.

Existentes especies que no responden adecuadamente a la formación de callos, en estos casos habrá que buscar las alternativas de órganos aptos para que funcione el sistema. En algunas dicotiledóneas por ejemplo, se puede usar semillas germinadas que estén en el pleno crecimiento. Afortunadamente, una gran mayoría de especies vegetales responden al modelo establecido en tabaco en su característica de permitir el uso de gran variedad de explantes.

Estos ejemplos muestran que cada especie tiene una respuesta diferente al cultivo de tejidos, lo que esta relacionado al tipo de explante. En cuanto a la especie, se debe tomar en cuenta la variación genética, pues el genotipo de la planta dentro de una especie es determinante para el éxito del proceso. Se ha observado que bajo las mismas condiciones ambientales y con el mismo explante, la respuesta de distintas variedades es diferente.

Si se encuentra estos problemas de genotipo, pequeños cambios de la concentración del medio de cultivo o reguladores de crecimiento, puede ser suficiente para solucionar el problema. Las respuestas de la los explantes pueden variar significativamente con el estado de desarrollo y edad de los mismos. Si se trabaja con especies leñosas, es importante usar explantes provenientes de plantas jóvenes u otras partes de las mismas en pleno desarrollo. En algunas especies, como el maní o la arveja la regeneración de las plantas a partir de hojas esta limitada al uso de plantas muy jóvenes.

Con relación al tamaño del explante se puede mencionar que cuanto mas grande sea hay mayores posibilidades de proliferación de callos, aunque ello permita una alta heterogeneidad ola contaminación con microrganismos, existentes un tamaño mínimo y máximo del explante (0.1 mm – 5 cm), tamaños por debajo de lo mínimo, no produce proliferación de callos u otras respuestas que posibiliten la formación de una nueva planta o clon.

Bibliografía:

sábado, 20 de octubre de 2012

ensayo del Premio Nobel de Medicina 2012 por estudio de células madres: Dr. Yamanaka y Dr. Gurdon

Ensayo:

Según el acta del premio, Gurdon (Dippenhall, 1933) y Yamanaka (Osaka, 1962) reciben en Nobel "por el descubimiento de que las células maduras se pueden reprogramar para convertirse en pluripotentes".

En una investigación que revolucionó el campo de la medicina regenerativa, Yamanaka descubrió que sólo cuatro genes eran suficientes para transformar células adultas en células como las de un embrión –a las que llamó células madre plutipotentes inducidas, más conocidas como células iPS-. A diferencia del descubrimiento de Gurdon, que había sido recibido con escepticismo, el de Yamanaka fue reconocido inmediatamente como un hito.

Todos partimos de una única célula, el resultado de unir un óvulo y un espermatozoide. Está única célula se va multiplicando y generando células inmaduras que tienen la capacidad de producir todas las distintas células de un organismo, desde neuronas hasta las células de los huesos o la piel. Estas células inmaduras se llamancélulas madre pluripotenciales. En el pasado se creía que el viaje era en una única dirección: de inmaduras a maduras. Los trabajos de John B. Gurdon y Shinya Yamanaka demostraron que la dirección opuesta también era posible: las células adultas pueden reprogramarse para convertirse en células inmaduras capaces de generar células de cualquier tejido.

Opinión :

En la investigacion llevada a cabo por los científicos: John B. Gurdon y Shinya Yamanaka demostraron en su investigacion que las células pluripotentes tienen el potencial de diferenciarse en cualquier otra célula del organismo, por lo que se espera poder utilizarlas en un futuro para regenerar órganos y tejidos dañados en los seres vivos.

En el año 1962 el científico John B. Gurdon  realizó un experimento en el cual supuso con  que en el genoma de una célula adulta sigue existiendo la información genetica  para convertirse en cualquier célula. 

Todos estos descubrimientos nos dan a entender que podemos generar todo tipo de células a partir no solo de células madre embrionarias sino de células maduras. Estas células nos ayudan a comprender los mecanismo de desarrollo y nos ofrecen la oportunidad de nuevas terapias médicas ya que ayudan a la regeneración de células .

Bibliogriafía: 

miércoles, 17 de octubre de 2012

(TAREA)Tabla de volumenes a esterilizar por tiempo

   Ø   MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
 
            Los métodos convencionalmente usados se pueden clasificar de acuerdo al agente y/o proceso esterilizante en:
 
Ø  Calor húmedo
Ø  Calor seco
Ø  Químicos
Ø  Radiaciones
Ø  Filtración

Ø  CALOR HÚMEDO:

ØVapor saturado a presión superior a la normal
 
Bajo estas condiciones se logran temperaturas superiores al punto de ebullición del agua. Generalmente se emplea una presión de vapor de una atmósfera por encima de la presión normal, lo que corresponden a una temperatura de 121°C. El poder de penetración del vapor a esta temperatura es muy alto, lo suficiente como para destruir en 15 a 20 minutos, dependiendo del volumen del material a esterilizar, esporas que sobrevivirían a la ebullición durante horas. Por éste método se pueden esterilizar soluciones, medios de cultivo, material de vidrio, ropa, en general materiales que soporten la temperatura de esterilización. Existen varios tipos de autoclaves siendo el más comúnmente usado el de Chamberland. El equipo consiste en una caldera metálica (en general de cobre) rodeada por una camisa externa también metálica de forma cilíndrica, en cuya parte inferior, y por debajo de la caldera, se encuentra la fuente de calor. La caldera lleva en su interior un doble fondo desmontable y perforado sobre el cual se coloca el material a esterilizar. La parte superior cierra con una tapa de bronce que ajusta perfectamente mediante una junta de goma de siliconas y una serie de tornillos de bronce. La tapa presenta tres elementos que comunican con el interior de la caldera: el manómetro, que generalmente indica presión sobre la atmosférica, la válvula de seguridad, y la llave de salida de vapor o espita.
 
Ø  INSTRUCCIONES PARA SU USO.
 
Cuando el autoclave se usa con vapor saturado a presión superior a la normal se deben seguir los siguientes pasos:
1.      Colocar agua en la caldera procurando que su nivel no alcance a los objetos que se colocarán en su interior. AL material a esterilizar sólo le debe llegar el vapor que es el agente esterilizante.
2.      Cargar el material a esterilizar debidamente acondicionado.
3.      Cerrar el autoclave ajustando los tornillos de su tapa en posición cruzada, a fin de asegurar un cierre parejo y hermético. De ésta manera se prolonga la vida útil de la junta de siliconas, cuyo espesor debe ser homogéneo en todo el recorrido.
4.      Abrir la salida de vapor y encender la fuente de calor.
5.      Asegurarse el correcto estado de la válvula de seguridad.


6. La salida de vapor debe estar abierta para desalojar el aire interior, hasta que salga un chorro continúo y abundante de vapor. La temperatura de trabajo, 121°C se alcanzará a la presión de una atmósfera sobre la normal solo si dentro del autoclave existe vapor en equilibrio con el agua, por lo cual es necesario asegurar la eliminación de aire del interior de la caldera. Si no se logra la adecuada eliminación del aire, la presencia de aire mezclado con vapor de agua resultara en una temperatura inferior a 121°C. De lo dicho se deduce que el manómetro podrá marcar una atmósfera de sobrepresión, pero si no se ha efectuado una correcta eliminación de aire la temperatura será inferior a la esperada.
7.      Purgar el aparato: se cierra y se abre tres veces la llave de salida de vapor, para eliminar los restos de aire.
8.      Cerrar. Calentar hasta que el manómetro indique la presión deseada. Regular la fuente de calor para mantener la presión constante. A partir de ese momento comenzar a contar el tiempo de esterilización.
 
El tiempo de exposición varía con el volumen de los líquidos contenidos en distintos recipientes:
 
RECIPIENTE
VOLUMEN
(ml)
TIEMPO DE EXPOSICIÓN
(min)
              Vaso de precipitado
20
                  12-14
Matraz erlenmeyer
50
12-14
Matraz erlenmeyer
200
12-15
Matraz erlenmeyer
1000
20-25
Matraz erlenmeyer
2000
30-35 

Los tiempos son válidos para un tratamiento a 121C
 
Una vez transcurrido el tiempo de tratamiento, apagar la fuente de calor y esperar que el manómetro marque cero. Recién en ese momento se puede abrir la llave de salida de vapor y luego la tapa del autoclave para retirar el material.
 
Ø Vapor fluente o vapor a presión normal
 
El autoclave puede utilizarse empleando vapor saturado a 100 C (presión atmosférica). En este caso se trabaja con la llave de salida de vapor abierta. Cuando sale un chorro de vapor continuo y abundante, se purga el aparato y se deja abierta la llave. A partir de ese momento se cuenta el tiempo de exposición.
Este proceso conocido como tyndalización utiliza la acción intermitente del vapor o la esterilización fraccionada. Se utiliza para la esterilización de materiales que no soportan temperaturas superiores a 100 °C. El proceso consiste en un calentamiento a 100°C durante 30 minutos en el que mueren las bacterias en estado vegetativo. Luego se deja a temperatura ambiente durante una noche y se repite la operación, se deja nuevamente a temperatura ambiente y se procede aun tercer y último calentamiento.
El método se basa en que en el primer calentamiento se logra destruir las formas vegetativas y se estimula la sensibilización de las formas esporuladas por acción de la temperatura y el medio líquido. En los posteriores calentamientos las formas esporuladas , ahora sensibilizadas, serán destruidas.
Este método puede utilizarse para la esterilización de leche, gelatina nutritiva, solución de azúcares con concentraciones superiores al 10 %, etc.
 
Bibliografía :