La hibridación Southern blot (SB)
Necesita de la extracción del ADN de la muestra con fenol/cloroformo y de la eliminación de ARN y proteinas de la misma por digestión enzimática. Con la aplicación de endonucleasas de restricción-la enzima Pst I es la mas utilizada, pues corta los genomas en fragmentos de diferentes tamaños ofreciendo un patrón característico en el gel de agarosa-el ADN se rompe, realizándose una separación electroforética de los fragmentos en gel de agarosa los cuales pueden ser visualizados con bromuro de etidio. El ADN se desnaturaliza y se transfiere a una membrana realizándose una hibridación. El SB es el método de referencia actual de. La especificidad de esta técnica es superior a cualquier otra debido a la purificación extra del ADN por electroforesis. Además es el único método que permite conocer si el genoma viral está en situación episomal o integrado en el ADN celular. Las desventajas fundamentales del SB son su gran complejidad técnica, duración de la misma y la necesidad de utilizar tejidos no fijados, puesto que existen protocolos para material fijado, su sensibilidad se reduce muy notablemente.
La hibridación Northern
se utiliza para la detcción de RNA. El ARN celular se extrae y se separa por medio de un gel desnaturalizante que contiene formaldehido. Seguidamente se hibridan con sondas ARN antisense o ADN.
Northertn Blot: pero permite detectar RNA en vez de DNA (Innis yGelfand, 1990). En síntesis la técnica consiste en extraer el RNA de las células pertinentes y suposterior separación por tamaño mediante electroforesis en gel. Las moléculas de RNA sontransferidas y unidas al filtro, al igual que en el Southern blot. Después de la hibridación con unasonda marcada (y posterior a la detección según el método de marcaje utilizado), las bandas en elgel indican la ubicación de los tipos de RNA que sean complementarios a la sonda. Teniendomarcadores de RNA de tamaño adecuado, se puede conocer el tamaño de los RNA que se hanidentificado. Así, la técnica permite conocer el tamaño preciso de un mRNA, luego del empalmetranscripcional. Además, sirve para identificar diferentes tipos de mRNA codificados por un mismogen y para determinar la cantidad y el tejido específico (o tipo de células) en que se encuentra unmRNA específico. Así, será posible determinar los niveles de actividad génica, por ejemplo durante el desarrollo, o bien en distintos tejidos (o tipos celulares) durante un período definido dela vida, o después de haber sido sometido a los organismos a diferentes estímulos fisiológicos(Russel, 1998).
Es una técnica muy similar al Southern Blot que permite la identificación desecuencias específicas de RNA.La muestra de RNA a analizar no requiere fragmentación y se somete a electroforesis en geles deagarosa, donde las moléculas de RNA se separan desde mayor a menor tamaño.Una vez terminada la electroforesis, y sin teñir el gel, los fragmentos se traspasan a un filtro denitrocelulosa ó a una membrana nylon, luego el filtro se incuba con una sonda marcada, específicapara la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo cDNA, que reconocerá a la secuencia deRNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidosnucleicos.
En todos los sistemas de hibridación descritos anteriormente el ácido nucléico diana está localizado en un soporte sólido, bien una membrana o una biopsia o extendido citológico, en los procedimientos que seguidamente describiremos el ácido nucleico se encuentra disuelto en un líquido.
Detalle de la tecnica de Southern
Esta técnica fue descrita por el Dr. Southern en 1975 y constituye el método más utilizado para analizar la estructura del ADN cortado por enzimas de restricción. Para la realización de esta técnica se debe extraer ADN genómico, se pueden extraer de 200 a 300 nanogramos de ADN con lo que se pueden realizar de 20 a 30 "digestiones" con enzimas de restricción.
Después de dicha digestión, el aproximadamente millón de fragmentos de ADN obtenidos, se separan entre sí, según su tamaño , en un gel de agarosa, sometido a un campo de corriente continua en una cubeta de electroforesis. El ADN posee una carga eléctrica negativa por lo que se desplaza hacia el polo positivo. Los fragmentos más pequeños se desplazan a mayor velocidad que los más grandes (Fig.)
Figura
2.13. Representación esquemática de la técnica de Southern Blotting para el
estudio de las secuencias específicas en el ADN genómico.
Con el electroforesis convencional se separan fragmentos entre 100 y 30.000 pares de bases. Cuando se marca con un colorante fluorescente (bromuro de etidio), el ADN separado de esta forma, aparece como una mancha homogénea de material fluorescente debido a que existen demasiados fragmentos de ADN como para que puedan diferenciarse entre sí.
La técnica de Southern Blotting permite identificar uno o dos fragmentos de ADN de interés en el aparentemente uniforme colección de millón de fragmentos cortados con la enzima de restricción. El siguiente paso consiste en la desnaturalización de los fragmentos de cadena doble para obtener fragmentos de cadena única. Esto se logra con un bufer de Ph básico.
La molécula de cadena única es transferida desde el gel a una membrana de nilón o a papel de nitrocelulosa, ayudado por capilaridad.
La identificación de uno o más fragmentos de interés se logra con una sonda específica marcada con radioactividad o colorimetría. La sonda marcada se incuba con el filtro de nilón o nitrocelulosa en una solución que favorece la formación de ADN de doble cadena. Después de lavar el filtro, para retirar la sonda que no se unió a su cadena complementaria, el filtro se expone a un film de Rx durante 24 a 48 horas, para observar la posición de uno o más fragmentos a los que la sonda ha hibridizado, lo que se observa como una banda negra después del revelado. (Fig. )
Bibliografía:
Apuntes de clases Y
http://es.scribd.com/doc/7176351/Southern-Northern-Western-Blot
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