4.2.4. VECTORES DE CLONACION

Los vectores son unidades de ADN que se autoreplican en un microorganismo o células humanas y los cuales pueden portar fragmentos de ADN de origen diverso. El vector debe contar con los elementos que le permitan ser replicados y mantenidos por la maquinaria celular hospedadora. 

Los vectores son propagados en hospedadores que pueden ser células de E. coli, levadura (S. cerevisiae) o células mamíferas. Los vectores pueden ser estructuras sencillas como plásmidos o muy complejos como los cromosomas artificiales de levadura (YAC) (5) y los cromosomas artificiales mamíferos (MAC) (6). 

los vectores tienen diferente capacidad de portar longitudes variables de secuencias de ADN. Los cromosomas artificiales mamíferos se vislumbran como vectores de terapia genética de condiciones causada por genes mayores como el de la distrofina, cuya disfunción causa la distrofia muscular de Duchenne-Becker, gen que tiene una longitud de secuencia de 2.4 Mb (7).

TIPOS de VECTORES y HOSPEDADORES
VECTOR	HOSPEDADOR	ESTRUCTURA	CAPACIDAD kb
Plásmidos Bacteriófagos Cósmidos BACs YACs MACs	E.coli E.coli E.coli E.coli Levadura Células mamíferas	Plásmidos Circulares Plásmidos Circulares Plásmidos Circulares Plásmidos Circulares Cromosomaslineales Cromosomaslineales	5-10 5-10 35-45 hasta 300 100-2000 >1000

Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación.

Figura a En esta secuencia de dibujos se puede ver como se realiza la inserción de un gen en un plásmido. En la figura a tenemos un gen(color rojo) que interesa insertar en un plásmido (color turquesa)

Figura b. En la figura b, vemos como una enzima de restricción ha cortado el gen y el plásmido, quedando unos bordes cohesivos o pegajosos.

Figura c .La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonación, se realiza por medio de otras enzimas, denominadas ADN-ligasas, que unen ambos trozos de ADN. El resultado es una molécula de ADN recombinante, ya que contiene fragmentos de ADN de distinta procedencia.

Plásmido R:  La resistencia a ciertos antibióticos y otras drogas puede ser transferida de una célula bacteriana a otra por este tipo de plásmido. La resistencia a las drogas generalmente es el resultado de la síntesis de enzimas que degradan la droga o que establecen una nueva vía enzimática para eludir los efectos.

El plásmido usado en ingeniería genética debe tener un número limitado de sitios de restricción y genes de resistencia a antibióticos específicos. Ésta característica permitirá su rastreo. Si el plásmido utilizado presenta genes resistentes a la ampicilina y a la tetraciclina y los sitios de restricción están dentro de estos genes, el objetivo será mediante una enzima de restricción cortar la molécula de ADN por un sitio que esté incluido dentro de uno de los genes resistente a antibióticos, el cual quedará inactivo. Si el ADN a recombinar se inserta dentro del gen de resistencia a la tetraciclina éste se inactivará, quedando activado el gen de resistencia a la ampicilina.

La célula que contenga el plásmido recombinante podrá identificarse ya que será resistente a la ampicilina y sensible a la tetraciclina. Un cultivo en placa que contenga el antibiótico ampicilina permitirá que se desarrollen sólo las colonias que hayan incorporado el plásmido.

Bacteriófagos: No penetran en la célula como otros virus, sino que se adosan a la pared celular y entran en contacto con la célula bacteriana mediante las fibras de cola (pie). Practican un orificio en la bacteria e inyectan, mediante la contracción de su cola, el ADN que se encuentra en su cabeza.
Luego de la infección comienza la síntesis propia del virus utilizando la maquinaria celular del huésped para su reproducción. Al cabo de un corto período se encontrarán dentro de la célula muchos bacteriófagos (fagos) nuevos; la célula bacteriana se lisa (colapsa), liberando los hijos del virus que estarán en condiciones de infectar a otras bacterias.

Para clonar por medio del vector  l se corta el ADN vírico en dos sectores con una enzima de
restricción, separando su zona central y quedando dos fragmentos que serán aislados para ser ligados con ADN ligasa al ADN foráneo que previamente fue cortado con la misma enzima. La parte central es descartada pues no afecta la capacidad del fago l para infectar células. Una vez obtenida la molécula recombinante se introduce en la célula hospedadora por medio de transfección y se sintetizan fagos descendientes infectivos que contendrán el ADN insertado.

Cósmidos:  Los vectores híbridos, constituidos por parte del cromosoma del fago l y el ADN
plasmídico, permiten la clonación de fragmentos largos de ADN foráneo.
Durante la clonación las moléculas de ADN recombinante se empaquetan en la cubierta proteica del
fago y una vez que el cósmido entra en la célula huésped se replica como un plásmido.
El ADN plasmídico posee genes resistentes a antibióticos que permitirán identificar las células
plasmídicas que los contiene.
Ejemplo de vector:  Agrobacterium tumefaciens (Gram -) –Atu-, posee un plásmido Ti que es el
responsable de su virulencia. Al transferirse al vegetal este segmento de ADN (T-ADN) puede contener el ADN
a transferir entre las secuencias de sus extremos (vector binario: contiene dos plásmidos, uno es el gen
implantado y el otro es el marcador de resistencia a un antibiótico –kanamicina- para vegetales). Posee un origen de replicación igual que el de la  Escherichia coli –Eco- (organismo hospedador para la clonación). Se transforma en Eco, luego se tranfiere por conjugación a Atu. Para completar el proceso la Atu debe contene la otra parte del sistema de vector binario transfiriendo el T-ADN a la planta.  Este otro plásmido contiene una región de virulencia (vir) de un plásmido Ti desactivado (D- Ti), que dirige la transferencia pero no posee los genes que provocan la enfermedad.


Luego de la recombinación con un cromosoma del hospedador el ADN foráneo se expresará  y conferirá las nuevas propiedades a la planta. Tipos de plantas tratadas: dicotiledóneas (tomate, papa, tabaco, soja, alfalfa, algodón) o leñosas (nogal y manzano). monocotiledóneas (gramíneas) son tratadas con mayor éxito con el método de disparadores de partículas.

Bibliografía:

APUNTES DE CLASES. Y

http://www.biblioteca.unp.edu.ar/bcentral/Doc_digitales/Organismos%20Geneticamente%20Modificados%20_OGM_%20Usos%20Alimentarios.PDF