Cultivo in vitro de ápices meristemáticos

Introducción

La regeneración  de plantas sanas partiendo del cultivo in vitro de ápices meristemáticos de ciertos vegetales leñosos exige la búsqueda de técnicas complejas y su empleo acertado. Esas técnicas deben permitir al explante sortear frecuentes dificultades como la oxidación, la heterogeneidad de respuestas, la reversión al estado juvenil, la presencia de inhibidores de enraizamiento y, sobre todo, la sobrevivencia al trasplante en condiciones autótrofas.

Buscando una mejor respuesta del ápice meristemático de algunos cítricos, Murashige et al. (1972) y Navarro et al. (1975). Plantearon la posibilidad del microinjerto in vitro de ápices sobre plántulas provenientes de semillas, logrando así el desarrollo de plantas libres de numerosos virus (Navarro y Suárez, 1977; Roistacher, 1977).El microinjerto in vitro fue aplicado más tarde al manzano (Alskief y Villemur, 1978), al damasco (Martínez et al., 1979) y a las vides (Engel- brecht y Schwerdtfeger, 1979) en las que se obtuvieron ejemplares libres de virus.

Introduciendo algunas modificaciones a las técnicas disponibles, fue posible regenerar plantas de duraznero libres de virus  como  Sharka  o Plum Pox y algunas cepas del Necrotic Ringspot Virus (NRSV), cuando se microinjertaron in vitro ápices del cultivar GF 305 (Mosella, 1979). Por otra parte,  Navarro et al. (1982) informaron acerca de la eliminación de virus como el Prunus Dwarf Virus (PDV) y el Chlorotic Leaf Spot Virus (CLSV) empleando el microinjerto  de distintas variedades de duraznero.

Otra técnica, denominada ‘microinjerto in vivo’ de ápices meristemáticos pretratados in vitro, fue propuesta por Mosella et al. (l980b) e ilustrada por Jonard et al. (1983). Con esta técnica se obtuvieron también plantas sanas de Prunus persica (L.) Batsch y con menos complicaciones que con la técnica original in vitro. En 1983, Ascui aplicó estos nuevos procedimientos a diversos cítricos y obtuvo resultados promisorios que esperan los indizajes virológicos correspondientes.

Procedimiento:

Micro injerto in vitro

1.  Preparación del porta lnjerto. Se describe la obtención de plántulas de dos especies que se usarán como porta injertos.

Dureznero. Las semillas desprovistas del endocarpo se esterilizan con alcohol de 950 durante 2 min y luego se tratan con hipoclorito de calcio (9%-12% ) mas 0.1% 190 de Tween-20 durante 30 a 60 min. Luego se enjuagan tres o más veces con agua destilada estéril. 

Las semillas se siembran así asepticamente en 40 ml de medio nutritivo gelificado (Knop-Heller)' contenidos en tubos de vidrio de 170 x 30 mm que se.tapan con algodón hidrófobo y papel de aluminio. El medio de cultivos.contiene agar (8-9 g/ litro), sacarosa (40-60 gJ litro), y su pH se regula entre 5.5 y 5.6. En todos estos ensayos los medios fueron esterilizados en autoclave a 105° C dos veces: la primera durante 15 min, y 24 horas después durante 5 min.

La estratificación durante un lapso de 60 a 90 dias a 4° C en la oscuridad favorece la ruptura de la dormencia de prunus persica  cv. GF 305. Luego de este plazo, y en un tiempo de 4 a 9 dias a 27° C en la oscuridad, se obtienen las plántulas que servirán de portainjerto.

Cítricos. Semillas del ‘citrange’ Troyer, cuyas cubiertas seminales han sido removidas, se esterilizan superficialmente con NaOCl(0.5%) al  que se añaden algunas gotas de Tween-20 como agente humectante. Luego se enjuagan tres o más veces con agua destilada estéril. Se siembran las semillas así tratadas en 40 ml de medio nutritivo (Murashige et al., 1962) gelificado (l %), con 20 g/ litro de sacarosa, a un pH de 5.6, en tubos de vidrio de 170 x 30 mm y se colocan a 24° C en  la oscuridad; se logra así la germinación y el crecimiento de las plántulas unos 15 días después. En un lapso de 3 a 4 semanas, el epicótilo mide más o menos 6 cm de longitud y las plantas están ya listas para el microinjerto.

2. Obtención del ápice meristemático. El ápice meristemático mide de 0.2 a 0.4 mm en cítricos [(Citriis sinensis (L.) Osbeck cv. Thomson y Citrus limon (L.) Burm. f. cvs. Génova, Eureka y Lisboa)] y de 0.6 a l mm en el duraznero (p. persica cv. GF 305); comprende el meristema propiamente dicho y uno o dos primordios foliares. El meristema se obtiene de los brotes terminales de plantas mantenidas en el invernadero o de plantas cultivadas de 2 a 3 afios en el campo, si se trata de cítricos. Los brotes se esterilizan superficialmente con etanol 80% ( v/ v) durante 2 a 3 min y luego durante 10 a 15 min con hipoclorito de calcio (6%-9%) que contenga 0.1%  de Tween-20. Luego los brotes se lavan con agua destilada estéril tres o más veces. ‘La operación se realiza con la ayuda dé un binocular de 20 aumentos en una cámara de flujo laminar.

3. Microinjerto. Los portainjertos desarrollados en condiciones estériles se extraen del tubo de germinación en la cámara de flujo; se les secciona el epicótilo a 2 cm del cuello, y se eliminan los cotiledones lo mismo que las yemas laterales si se trata de cítricos. La operación se realiza sobre una caja Petri estéril.

El ápice ‘injerto’ se coloca sobre la superficie decapitada y en contacto con la zona vascular, en el duraznero. En los cítricos, en cambio, se hace una escisión en la corteza del epicótilo en forma de t invertida.

La plántula injertada se coloca en un redondel de papel filtro perforado en su centro que le servirá de soporte en el tubo de vidrio, de manera que el sistema radical quede en contacto con un medio nutritivo líquido. Para los durazneros, este medio contiene macroelementos de Knop, microelementos de Heller, y vitaminas de Miller junto con 60 g/ litro dc sacarosa, a un pH de 5.6. En los cítricos se utiliza cl medio clásico de Murashige et al. (1962),  al cual  se  adicionan  tiamina-HCl  (0.2 mg/ litro), piridoxina-HCl (1.0 mg/ litro), ácido nicotlnico (1.0 mg/ litro), mioinositol (100 mg/ litro),y sacarosa (75 g/ litro); pH -5.6.

4. Incubación. Los microinjertos se incuban en una cámara de ambiente controlado a 24+- 2°c , con una intensidad lumínica que varia de 600 lux (durazneros) a 1400-1600 lux (cítricos), y con 16  horas de luz por día. El período de incubación es de 20 a 60 días en durazneros y de 30 a 40 días en cítricos, momento en que las plantas se trasplantan  a macetas.

5. Trasplante a macetas. Logrado el desarrollo del injerto, las plántulas se extraen de los tubos y sus raíces se  lavan profundamente con agua a fin de eliminar los restos del medio de cultivo. Luego se llevan a maletas que contienen un sustrato arena/ turba (50%-50%) para los cítricos  y turba, tierra de hoja y arena (en ciertas proporciones) para los durazneros. Estas mezclas se esterilizan previamente en autoclave a 130°c durante 30 min, o directamente mediante la aplicación de vapor durante una hora.

Las plántulas se cubren en las macetas con una bolsa de polietileno o con un frasco de vidrio para reducir los efectos de la deshidratación. Las plantas se colocan más tarde en zonas sombreadas del invernadero, donde se adaptan a las condiciones normales del cultivo porque se abren paulatinamente las bolsas y aumenta gradualmente la intensidad lumínica. Posteriormente se realizan los ‘indizajes’ virológicos.

Cultivo directo de ápices

Tanto en Citrus limon cv. Gónova como en Prunus persica cv. GF 305, se logró la regeneración de plantas bien enraizadas partiendo del cultivo directo dc ápices in vitro. En el duraznero, los ápices, después de 20 a 30 días de cultivo in vitro sobre medios que favorecen su elongación, fueron especialmente repicados a medios gelificados (0.8:%) a los que se adicionaron auxinas (ANA o AIA, 0.5 mg/ litro) y compuestos fenólicos como la rutina o la quercetina(10-³ M); de esos ápices, 249, produjeron primordios radiculares en la oscuridad a 24° C, en un lapso de 2 a 3 semanas. Un nuevo cambio a un medio gelificado simple y sin hormonas (Knop m8s 10 g/ litro de sacarosa) y a un régimen de 6000 lux estimuló la elongación radicular y el desarrollo de la parte aérea de las plantas y determinó porcentajes de plantas libres. de virus similares a los obtenidos con las  técnicas anteriores.

El trasplante a macetas continúa como la limitante de este tipo de regeneración pues el éxito de esta operación no supera el 20%. En el limonero, por su parte, un l0% de los ápices cultivados sobre el medio de elongación y repicados al medio MI116 gelificado que contenga 2 mg/ litro de ANA y 259, de carbón activado emitieron raíces.

Las técnicas resumidas en la Figura 23.5 permiten regenerar plantas de difícil respuesta al cultivo in vitro partiendo de ápices meristemáticos cuya longitud no sea superior a 1 mm; brindan además la posibilidad de obtener material vegetal libre de ciertos virus que afectan las plantas madre de frutales como el duraznero, sin recurrir a tratamientos termoterapéuticos. Estos protocolos son aplicables también a especies de cítricos como el limonero y el naranjo, y se consideran una importante herramienta para resolver problemas de limpieza de virus en otras especies leñosas frutales o forestales; se pueden aplicar además a ápices de origen diverso como los de plantas infectadas por patógenos sistémicos, los de callos organogénicos, los dc embriones somáticos, los de embriones inmaduros, y otros.

Refuerzos como la termoterapia la quimioterapia, o ambas, podrian utilizarse incluso durante los períodos de cultivo in vitro o de pretratamiento de los ápices; éstos podrán cultivarse luego directamente o microinjertarse in vitro o in vivo, aumentando ast las posibilidades de eliminación de patógenos sistémicos.

El porcentaje de plantas libres de virus, regeneradas mediante algunos de estos métodos, podria aumentar considerablemente si se cuenta además con técnicas de propagación masiva o de micropropagación para multiplicar las plantas (o la planta) obtenidas de los ápices (Figura 23.6) mediante microestacas, por ejemplo (Mosella et al., l980a).

Bibliografía:
http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo23.pdf