domingo, 25 de noviembre de 2012

3.5.2.3. CRYOCONSERVACION DEL GERMOPLASMA

La crioconservación de plantas es un proceso consistente en la preparación, mantenimiento y preservación a largo plazo de un material vegetal, en unas condiciones de temperatura ultra bajas de –196 ºC, obtenidas mediante nitrógeno líquido (NL). Este método de conservación de material vegetal presenta una serie de ventajas frente a otros sistemas de preservación de recursos filogenéticos: es un método rápido, sencillo, no altera la estabilidad genética del material y reduce sustancialmente el esfuerzo y los costes que representan el mantenimiento de colecciones de germoplasma vegetal in vivo o in vitro, al eliminar casi por completo la mano de obra y evitar los riesgos fitopatológicos y fisiológicos que habitualmente aparecen en el mantenimiento de los bancos de germoplasma vegetales. Hay que señalar el importante ahorro de espacio que supone mantener una colección de especies hortícolas o leñosas en pocos metros cuadrados en vez de en plantaciones de cientos o miles de metros cuadrados.

La crioconservación, que describimos a continuación, puede ser aplicada ventajosamente a la conservación de especies y variedades vegetales silvestres o cultivadas como alternativa a las colecciones y bancos de germoplasma clásicos (bancos de semillas, colecciones en campo).}

Existen dos métodos de congelación. Podemos hablar de un método de congelación lento, y un método de congelación rápido.
  1. El método de congelación lento, también llamado método convencional de precongelamiento [Sakai y cols., 1991, Plant Physiology 137: 465-470].
  2. En el método de congelación rápido o simple, el material vegetal se congela inicialmente a –40 ºC, para pasarlo posteriormente al NL.
Bibliografía:
http://www.encuentros.uma.es/encuentros98/crioconservacion.htm

3.5.2.2. SUPRESION DEL CRECIMIENTO

Como se discutió antes, siempre existe un riesgo, mayor o menor, de inestabilidad citogenética cuando se conserva el germoplasma mediante el cultivo de tejidos in vitro a largo plazo. Este riesgo se puede minimizar utilizando tejidos organizados (meristemas, yemas y cultivos derivados) y reduciendo la tasa de crecimiento mediante la .temperatura baja. 

Conforme se reduce. la temperatura de un tejido, el metabolismo celular disminuye hasta llegar a un estado de ‘suspensión animada’ cuando la temperatura alcanza niveles inferiores a -150 0 C; a esta temperatura, los procesos biológicos han cesado y las posibles causas de inestabilidad se habrán, por tanto, minimizado o eliminado. Este tema se trhta con mayor detalle en el Capítulo 13 de esta obra.

Bibliografía:

3.5.2.1. FACTORES QUE LIMITAN EL CRECIMIENTO


La tasa de crecimiento de los cultivos in vitro puede controlarse empleando, principalmente, los siguientes factores: temperatura, nutrimentos inorgánicos y orgánicos, reguladores de crecimiento, y concentración osmótica del medio.

Otros factores, como el tamaño de los tubos de ensayo o de los frascos, la calidad y concentración del agente gelificante, la adición de carbón activado al medio, la limitación de la oxigenación, la intensidad de la luz y del fotoperiodo, entre otros, son también importantes en el control del crecimiento.

Temperatura: 
La reducción de la temperatura ha sido el rccurso más comúnmente utilizado para disminuir el crecimiento de los cultivos. La mayoría de los cultivos in vitro son mantenidos a temperaturas entre 20 0C y 30 °C; a temperaturas más bajas la tasa de crecimiento disminuye, pero esta reducción depende de la especie en cuestión (Withers, 1980).

Concentración de nutrimentos: 
La relación entre la concentración de carbohidratos y los componentes nitrogenados del medio nutritivo puede tener efectos sobre las tasas de crecimiento y la morfogénesis en los cultivos in vitro (Staritsky, 1980). La sacarosa tiene, igualmente, un efecto en la viabilidad de los cultivos: concentraciones muy £tas o.muy bajas de ese azúcar resultan nocivas para la conservación de los tejidos in vitro.

Concentración de los reguladores del crecimiento: 
Los niveles de citoquininas y de inhibidores del crecimiento, como el ácido absicico, interaccionan con la concentración de sacarosa y con la temperatura de conservación y afectan asi la viabilidad de los cultivos in vitro (Roca, 1985).
Entre los.reguladores del crecimiento empleados por. los investigadores figuran el acido abcisiico (ABA), el cloruro de fosfonio o clorfoniom (Phosphon-D), la hidrazida maleica o daminazida (B995), el cicocel o 2-cloroetíl-cloruro de trimetil (CCC); el ácido N-dimetil succínico y el ancimidol (Nam et £., 1979); y el ácido acctil salicflico, ASA(López, 1985).

Concentración osmótica:
La limitación del crecimiento por causa de la concentración osmótica se debe, posiblemente, a la reducción de la absorción de agua y de nutrimentos del medio. Puesto que es altamente metabolizable, la sacarosa actúa osmóticamente en concentraciones altas. Otros agentes osmóticos difíciles de metabolizar, como el manitol y el sorbitol, son posiblemente más efectivos que la sacarosa en la limitación del crecimiento de los cultivos, pero se debe tener en cuenta que estas sustancias interaccionan con el contenido de sacarosa. y con la temperatura de conservación.

Bibliografía:
http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo31.pdf

3.5.2. METODOS DE CONSERVACION


Hay dos sistemas básicos de conservación del germoplasma in vitro son:

A) mediante la limitación del crecimiento hasta tasas mínimas.
B) mediante la supresión total del crecimiento y del metabolismo celular.



Bibliografía:
http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo31.pdf

3.5.1.4. ESTRATEGIAS

Es grande el rango de especies vegetales cultivadas cuya conservación es accesible a las técnicas in vitro. La conservación de los recursos fitogenéticos mediante los métodos del cultivo in vitro se logra haciendo cambios en el ambiente de cultivo para desacelerar o suprimir totalmente el crecimiento de las células y de los tejidos; el objetivo es aumentar al máximo el período de trasferencia del cultivo o entenderlo indefinidamente. No obstante, debe realizarse; como se indicó anterior- mente, una evaluación científica cuidadosa de las ventajas y desventajas de una estrategia in vitro de la conservación de recursos genéticos para cada caso específico.


Se han propuesto dos tipos de conservación in vitro de los bancos genéticos (Withers y Williams,1985):

 a) el banco genético in vitro activo (IVAG, en inglés) donde los cultivos se mantienen en crecimiento lento.

b) el banco genético in vitro básico (IVBG, en inglés) donde los cultivos son crioconservados. El IVAG se está desarrollando, en alto grado, para.las especies yuca,. papa, batata, banano y caña de azúcar, y constituye una colección de trabajo; su contraparte estaría representada por la colección de campo y por la colección de semilla sexual almacenada a corto plazo. El IVBG constituye una colección básica es decir, conservada en plazos largos y no activa o de trabajo ya que la criopreservación no se ha desarrollado aún plenamente en ningún cultivo; este banco permite un mantenimiento total de la estabilidad genotipica del germoplasma, y su contraparte estaría representada por la colección de semilla sexual mante- nida bajo almacenamiento a largo plazo.

Bibliografía:
http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo31.pdf

3.5.1.3. ESTABILIDAD GENETICA


La estabilidad genética de los cultivos ha sido, durante mucho tiempo, un motivo de inquietud cuando se piensa aplicar las técnicas in vitro para la conservación dcl germoplasma. El material recuperado de la conservación in vitro debe representar genéticamente al material utilizado. Cualquier sistema de cultivo in vitro será inaceptable si introduce un alto riesgo de inestabilidad genética o de selección entre genotipos o de ambas cosas (Withers, 1988).
En cultivos propagados vegetativamente se han aplicado criterios morfológicos para caracterizar  los genotipos, diferencias que son difíciles de detectar en los cultivos propagados in vitro. Se ha señalado que la variación genética causada por un reajuste cromosómico puede presentarse en el cultivo de tejidos (D’Amato, 1964). Existe también una correlación entre el tiempo en que el material vegetal se cultiva como callo y la probabilidad de que ocurran en él cambios cromosómicos; esto podría causar un cambio hacia un tipo variante en la propagación in vitro (Schilde-Rentschler y Roca, 1987)

Bibliografía:
http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo31.pdf

3.5.1.2. VIABILIDAD

La evaluación de la viabilidad de los cultivos in vitro se debe realizar sistemáticamente. En condiciones de crecimiento lento, en que el período de trasferencia se extiende durante meses o años, la frecuencia de evaluación de los cultivos aumenta en comparación con la evaluación que se haría al material conservado bajo nitrógeno líquido, por ejemplo. Las características más importantes que se evalúan en el almacenamiento de crecimiento lento de cultivos derivados del ápice de yemas son: contami- nación, senescencia de la hoja (la razón hojas verdes/ hojas muertas), número de brotes verdes (para micropropagación adicional), número de nudos viables (verdes) en relación con la longitud del tallo (verde), presen- cia o ausencia de raíces, y ocurrencia de callo.

Bibliografía:
http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo31.pdf