Enzimas de
restricción: producción de fragmentos de DNA para recombinación
Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción fueron descubiertas
por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans. Estas son enzimas sumamente
específicas que catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster de los
ácidos nucleicos y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en lugares
específicos, creando de esta manera una serie de fragmentos. Se ha visto que
ciertas cepas de E. coli degradan (cortan) el DNA de ciertos virus fagos
infectivos, a menos que los ácidos nucleicos presenten metilación (adición de
grupos metilo) en algunos residuos de adenina o citosina del sitio de corte.
La función de las enzimas de
restricción es la proteger al organismo de DNA extraño. Cuando una porción de
DNA foráneo ingresa a la célula, las enzimas de restricción se encargan de
degradarlo cortándolo en pequeños fragmentos, siempre y cuando éste no esté modificado.
Actualmente se conocen unas 200
enzimas de restricción (las más conocidas se muestran en la tabla 1), las
cuales se nombran de acuerdo al organismo del cual se extraen, como por ejemplo
EcoRI y EcoRII, que se extraen de E. coli o HaeIII que se extrae de
Haemophilusaegyptius.
Una característica de las enzimas
de restricción es el reconocimiento de secuencias palindromicas.
Tabla. Algunas de las principales enzimas de restricción conocidas y su
origen (en base a Griffiths et al. 1998).
Enzima de restricción
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Organismo de donde se extrae
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EcoRI
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Escherichiacoli
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EcoRII
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Escherichiacoli
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HindII
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Haemophilusinfluenzae
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HindII
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Haemophilusinfluenzae
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HaeIII
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Haemophilusaegyptius
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HpaII
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Haemophilusparainfluenzae
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PstI
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Providencia stuartii
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Mayi
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Serratiamarcesens
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BamI
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Bacillus
amyloliquefaciens
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BglII
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Bacillusglobiggi
|
Las enzimas de
restricción trabajan únicamente sobre secuencias específicas de bases
nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de
restricción y producen dos tipos de corte:
(1) corte con extremos cohesivos y
(2) corte con extremos romos (ver Fig. ) (Griffiths et
al. 1998).
Los extremos cohesivos dejan porciones lineales
a ambos lados del fragmento, es decir, quedan pequeñas secuencias de bases sin
aparear a cada lado, siendo éstas complementarias entre sí, mientras que los
extremos romos son aquellos en los que no queda una porción lineal a ninguno de
los lados.
De acuerdo a la especificidad de las enzimas de
restricción, se conocen dos tipos:
- -las enzimas de tipo I cortan en un sitio cercano al
sitio de restricción, a una distancia que varía aleatoriamente, y por ello no
se suelen emplear para DNA recombínate.
- -Las de tipo II reconocen y cortan en la secuencia
específica, y son las más empleadas en este tipo de protocolos por su alta
precisión.
- -Las enzimas de restricción de tipo III son similares
a las de tipo II en cuanto a la precisión del lugar de corte, pero se
diferencian de éstas en que sólo cortan entre nucleótidos del mismo tipo, por
ejemplo entre dos adeninas.Algunas enzimas de restricción como EcoRV encuentran
el sitio de restricción, por medio de un barrido a lo largo del surco mayor del
DNA y reconocen una secuencia palindrómica de seis nucleótidos de longitud, en
la que se presenta una simetría rotacional binaria. Cuando la enzima de
restricción encuentra el sitio de corte, se producen una serie de
reordenamientos estructurales en el DNA y se produce un ajuste inducido en el
cual el DNA sufre una torsión de 50 grados. En este proceso se va haciendo un
barrido muy rápido sobre la hebra de DNA, leyendo grupos de seis nucleótidos,
hasta encontrar la secuencia diana. Esto comprueba el carácter altamente
específico de las enzimas de restricción.
Los puntos de corte
de las enzimas de restricción pueden ser empleados como marcadores para la
elaboración de mapas de restricción. Para elaborar un mapa de restricción, se
tiñen los fragmentos resultantes de la lisis y se los separa mediante una
electroforesis PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida) y se establecen
las distancias de migración, siendo los resultados muy específicos para cada
molécula de DNA en estudio.
Los extremos cohesivos son los más empleados en la
construcción de DNA recombinante, puesto que al tener una porción lineal
"pegajosa" es más sencillo que se produzca la unión con el DNA del
hospedero, por complementación de bases, dicha unión se produce por la
intervención de enzimas denominadas ligasas. Adicionalmente, la enzima
transferasa terminal puede ser usada para generar extremos cohesivos en un
fragmento de DNA. A pesar de ser más difícil, también es posible realizar
uniones de extremos romos, mediante la adición de conectores sintéticos de DNA
que actúan a manera de extremos cohesivos (como el caso de la transferasa
terminal), sin embargo este procedimiento no es de mucha utilidad para realizar
una clonación directa de DNA.
Existe otro tipo de
enzimas de restricción de doble función, denominadas endo–exonucleasas, las
cuales son capaces tanto de añadir nucleótidos como de removerlos de una hebra
de DNA. Estas enzimas también son muy específicas y reconocen secuencias
exactas, plantea que las enzimas de restricción del tipo endo–exonucleasas
pueden tener un papel fundamental en la reparación del DNA y/o en la muerte de
células defectuosas, gracias a la especificidad de la enzima. Se han hecho
numerosos experimentos con endo–exonucleasas aisladas de E. coli,
Neurosporacrassa, Aspergillus nidulans, mitocondrias de Saccharomycescerevisiae,
Drosophila melanogaster, células de mono y células leucémicas de humano.
Bibliografía:
Apuntes de clases.
