2.3. ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE TEJIDOS

La biotecnología vegetal hace posible que los proyectos agropecuarios tengan mas realce y despunte a la hora de ejecutarlos, ahora vamos a entender sobre el establecimiento del cultivo de tejidos vegetales in vitro.

El termino cultivo de tejidos es muy amplio y tiene numerosos objetivos, dependiendo de la orientación que se quiera dar al laboratorio. La técnica de cultivo de tejidos in vitro es muy heterogénea mediante las cuales un explante, que no es mas que la parte separada de un vegetal, por ejemplo un trozo de hoja, tejido, etc., se cultiva asépticamente en un medio de composición química definida, para luego incubarla en a condiciones ambientales controladas.

La separación del explante y las operaciones relacionadas con su incubación in vitro, dependerá en gran medida del tipo de explante y del sistema de cultivo in vitro que se emplee, basándose desde luego en los objetivos que se persigan. Para el establecimiento de cultivo de tejidos, se deben analizar aspectos importantes tales como: el explante, la sepsia, los medios de cultivo y las condiciones ambientales de incubación.

EL EXPLANTE

Durante el proceso de establecimiento de cultivo de tejidos, la selección del explante apropiado constituye el primer paso a tomar. Esta elección se basa en el objetivo perseguido y la especie vegetal a usar.

El explante es la parte de la planta a partir del cual se inicia el cultivo.

Dependiendo de la especie y si las condiciones ambientales que se proporcionan al explante son adecuados uno de ellos podría proporcionar cienos de plantas. El tamaño del explante varía desde los 0.1 mm hasta piezas de tallo de 5 cm o más. Los explantes pueden ser meristemos, puntas de brotes, tallos, anteras, flores, hojas, embriones, semillas, raíces y yemas.

Si en el laboratorio se planifica obtener plantas provenientes de callos, los explantes obtenidos anteriormente son muy útiles, ya que cualquier explante con células nucleares son muy útiles para obtener callos.

Existentes especies que no responden adecuadamente a la formación de callos, en estos casos habrá que buscar las alternativas de órganos aptos para que funcione el sistema. En algunas dicotiledóneas por ejemplo, se puede usar semillas germinadas que estén en el pleno crecimiento. Afortunadamente, una gran mayoría de especies vegetales responden al modelo establecido en tabaco en su característica de permitir el uso de gran variedad de explantes.

Estos ejemplos muestran que cada especie tiene una respuesta diferente al cultivo de tejidos, lo que esta relacionado al tipo de explante. En cuanto a la especie, se debe tomar en cuenta la variación genética, pues el genotipo de la planta dentro de una especie es determinante para el éxito del proceso. Se ha observado que bajo las mismas condiciones ambientales y con el mismo explante, la respuesta de distintas variedades es diferente.

Si se encuentra estos problemas de genotipo, pequeños cambios de la concentración del medio de cultivo o reguladores de crecimiento, puede ser suficiente para solucionar el problema. Las respuestas de la los explantes pueden variar significativamente con el estado de desarrollo y edad de los mismos. Si se trabaja con especies leñosas, es importante usar explantes provenientes de plantas jóvenes u otras partes de las mismas en pleno desarrollo. En algunas especies, como el maní o la arveja la regeneración de las plantas a partir de hojas esta limitada al uso de plantas muy jóvenes.

Con relación al tamaño del explante se puede mencionar que cuanto mas grande sea hay mayores posibilidades de proliferación de callos, aunque ello permita una alta heterogeneidad ola contaminación con microrganismos, existentes un tamaño mínimo y máximo del explante (0.1 mm – 5 cm), tamaños por debajo de lo mínimo, no produce proliferación de callos u otras respuestas que posibiliten la formación de una nueva planta o clon.

Bibliografía:

http://agropecuarios.net/establecimiento-del-cultivo-de-tejidos-vegetales-in-vitro.html

ensayo del Premio Nobel de Medicina 2012 por estudio de células madres: Dr. Yamanaka y Dr. Gurdon

Ensayo:

Según el acta del premio, Gurdon (Dippenhall, 1933) y Yamanaka (Osaka, 1962) reciben en Nobel "por el descubimiento de que las células maduras se pueden reprogramar para convertirse en pluripotentes".

En una investigación que revolucionó el campo de la medicina regenerativa, Yamanaka descubrió que sólo cuatro genes eran suficientes para transformar células adultas en células como las de un embrión –a las que llamó células madre plutipotentes inducidas, más conocidas como células iPS-. A diferencia del descubrimiento de Gurdon, que había sido recibido con escepticismo, el de Yamanaka fue reconocido inmediatamente como un hito.

Todos partimos de una única célula, el resultado de unir un óvulo y un espermatozoide. Está única célula se va multiplicando y generando células inmaduras que tienen la capacidad de producir todas las distintas células de un organismo, desde neuronas hasta las células de los huesos o la piel. Estas células inmaduras se llamancélulas madre pluripotenciales. En el pasado se creía que el viaje era en una única dirección: de inmaduras a maduras. Los trabajos de John B. Gurdon y Shinya Yamanaka demostraron que la dirección opuesta también era posible: las células adultas pueden reprogramarse para convertirse en células inmaduras capaces de generar células de cualquier tejido.

Opinión :

En la investigacion llevada a cabo por los científicos: John B. Gurdon y Shinya Yamanaka demostraron en su investigacion que las células pluripotentes tienen el potencial de diferenciarse en cualquier otra célula del organismo, por lo que se espera poder utilizarlas en un futuro para regenerar órganos y tejidos dañados en los seres vivos.

En el año 1962 el científico John B. Gurdon  realizó un experimento en el cual supuso con  que en el genoma de una célula adulta sigue existiendo la información genetica  para convertirse en cualquier célula. 

Todos estos descubrimientos nos dan a entender que podemos generar todo tipo de células a partir no solo de células madre embrionarias sino de células maduras. Estas células nos ayudan a comprender los mecanismo de desarrollo y nos ofrecen la oportunidad de nuevas terapias médicas ya que ayudan a la regeneración de células .

Bibliogriafía: 

 

http://www.lavanguardia.com/vida/20121008/54352761212/premio-nobel-medicina-2012-gurdon-yamanaka.html

http://alt1040.com/2012/10/premio-nobel-2012-celulas-madre-pluripotenciales-inducidas

(TAREA)Tabla de volumenes a esterilizar por tiempo

   Ø   MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
 
            Los métodos convencionalmente usados se pueden clasificar de acuerdo al agente y/o proceso esterilizante en:
 
Ø  Calor húmedo
Ø  Calor seco
Ø  Químicos
Ø  Radiaciones
Ø  Filtración

Ø  CALOR HÚMEDO:

ØVapor saturado a presión superior a la normal
 
Bajo estas condiciones se logran temperaturas superiores al punto de ebullición del agua. Generalmente se emplea una presión de vapor de una atmósfera por encima de la presión normal, lo que corresponden a una temperatura de 121°C. El poder de penetración del vapor a esta temperatura es muy alto, lo suficiente como para destruir en 15 a 20 minutos, dependiendo del volumen del material a esterilizar, esporas que sobrevivirían a la ebullición durante horas. Por éste método se pueden esterilizar soluciones, medios de cultivo, material de vidrio, ropa, en general materiales que soporten la temperatura de esterilización. Existen varios tipos de autoclaves siendo el más comúnmente usado el de Chamberland. El equipo consiste en una caldera metálica (en general de cobre) rodeada por una camisa externa también metálica de forma cilíndrica, en cuya parte inferior, y por debajo de la caldera, se encuentra la fuente de calor. La caldera lleva en su interior un doble fondo desmontable y perforado sobre el cual se coloca el material a esterilizar. La parte superior cierra con una tapa de bronce que ajusta perfectamente mediante una junta de goma de siliconas y una serie de tornillos de bronce. La tapa presenta tres elementos que comunican con el interior de la caldera: el manómetro, que generalmente indica presión sobre la atmosférica, la válvula de seguridad, y la llave de salida de vapor o espita.
 
Ø  INSTRUCCIONES PARA SU USO.
 
Cuando el autoclave se usa con vapor saturado a presión superior a la normal se deben seguir los siguientes pasos:
1.      Colocar agua en la caldera procurando que su nivel no alcance a los objetos que se colocarán en su interior. AL material a esterilizar sólo le debe llegar el vapor que es el agente esterilizante.
2.      Cargar el material a esterilizar debidamente acondicionado.
3.      Cerrar el autoclave ajustando los tornillos de su tapa en posición cruzada, a fin de asegurar un cierre parejo y hermético. De ésta manera se prolonga la vida útil de la junta de siliconas, cuyo espesor debe ser homogéneo en todo el recorrido.
4.      Abrir la salida de vapor y encender la fuente de calor.
5.      Asegurarse el correcto estado de la válvula de seguridad.

6. La salida de vapor debe estar abierta para desalojar el aire interior, hasta que salga un chorro continúo y abundante de vapor. La temperatura de trabajo, 121°C se alcanzará a la presión de una atmósfera sobre la normal solo si dentro del autoclave existe vapor en equilibrio con el agua, por lo cual es necesario asegurar la eliminación de aire del interior de la caldera. Si no se logra la adecuada eliminación del aire, la presencia de aire mezclado con vapor de agua resultara en una temperatura inferior a 121°C. De lo dicho se deduce que el manómetro podrá marcar una atmósfera de sobrepresión, pero si no se ha efectuado una correcta eliminación de aire la temperatura será inferior a la esperada.
7.      Purgar el aparato: se cierra y se abre tres veces la llave de salida de vapor, para eliminar los restos de aire.
8.      Cerrar. Calentar hasta que el manómetro indique la presión deseada. Regular la fuente de calor para mantener la presión constante. A partir de ese momento comenzar a contar el tiempo de esterilización.
 
El tiempo de exposición varía con el volumen de los líquidos contenidos en distintos recipientes:
 

RECIPIENTE	VOLUMEN (ml)	TIEMPO DE EXPOSICIÓN (min)
Vaso de precipitado	20	12-14
Matraz erlenmeyer	50	12-14
Matraz erlenmeyer	200	12-15
Matraz erlenmeyer	1000	20-25
Matraz erlenmeyer	2000	30-35

Los tiempos son válidos para un tratamiento a 121C
 
Una vez transcurrido el tiempo de tratamiento, apagar la fuente de calor y esperar que el manómetro marque cero. Recién en ese momento se puede abrir la llave de salida de vapor y luego la tapa del autoclave para retirar el material.
 
Ø Vapor fluente o vapor a presión normal
 
El autoclave puede utilizarse empleando vapor saturado a 100 C (presión atmosférica). En este caso se trabaja con la llave de salida de vapor abierta. Cuando sale un chorro de vapor continuo y abundante, se purga el aparato y se deja abierta la llave. A partir de ese momento se cuenta el tiempo de exposición.
Este proceso conocido como tyndalización utiliza la acción intermitente del vapor o la esterilización fraccionada. Se utiliza para la esterilización de materiales que no soportan temperaturas superiores a 100 °C. El proceso consiste en un calentamiento a 100°C durante 30 minutos en el que mueren las bacterias en estado vegetativo. Luego se deja a temperatura ambiente durante una noche y se repite la operación, se deja nuevamente a temperatura ambiente y se procede aun tercer y último calentamiento.
El método se basa en que en el primer calentamiento se logra destruir las formas vegetativas y se estimula la sensibilización de las formas esporuladas por acción de la temperatura y el medio líquido. En los posteriores calentamientos las formas esporuladas , ahora sensibilizadas, serán destruidas.
Este método puede utilizarse para la esterilización de leche, gelatina nutritiva, solución de azúcares con concentraciones superiores al 10 %, etc.
 

Bibliografía :

http://www.google.com.mx/url?sa=t&rct=j&q=tabla%20de%20volumenes%20de%20esterilizacion%20por%20tiempo&source=web&cd=3&cad=rja&ved=0CC4QFjAC&url=http%3A%2F%2Fwww.biol.unlp.edu.ar%2Fmicrobiologiagral%2Fanexo-lab2esterilizacion.doc&ei=nhp_UNOuDaGi2gW9yoGQBw&usg=AFQjCNHBFO0F783_-gIyMxY5uTuf2qR10w

2.2.7. ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO

El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante).

Vapor a presión: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables como grados de temperatura y tiempo de exposición, que junto con el tamaño del autoclave y el flujo del vapor, la densidad y el tamaño de la carga en la cámara aumentan la tasa se muerte de los microorganismos, en una temperatura de 121ºC – 132ºC durante 15 minutos o más.

ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

1. Las cajas petri y pipetas envueltas en un autoclave a 120 o  a 15 libras de presión durante 20 min.

2. Los medios de cultivo se esterilizan de la misma manera en autoclave.

3. Verificar las instrucciones de uso del equipo

4.Revisar que el agua coincida con la marca del tubo indicador delautoclave.

5. Conectar el autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto.

6.Acomodar los medios y materiales en la canasta del autoclave ycolocarlo adentro

7.Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posiciónencontrada.

8. Esperar que salga el vapor de agua por el orificio de purgado, despuéscerrar este orificio

9. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121oc o 15 lb. Depresión revisando continuamente la escala del barómetro.

10. Se mantiene a esa temperatura y presión durante 15 min. Controlando laperilla de temperatura.

11. Apagar el autoclave y dejar que baje la presión al valor de 0.

12. Con los guantes de asbesto se abrió cuidadosamente la puerta, deadelante hacia atrás para evitar quemaduras por la salida de vapor.

13. Retirar la canasta del autoclave y sacar el material y medios de cultivos

BIBLIOGRAFÍA:

http://es.scribd.com/doc/40419378/PREPARACION-Y-ESTERILIZACION-DE-MATERIALES-Y-MEDIOS-DE-CULTIVO

http://www.slideshare.net/manueltoledo91/esterilizacion-y-medios-de-cultivo

2.2.6. ESTERILIZACION DE MATERIAL DE CRISTALERIA Y OTROS MATERIALES

MATERIAL DE CRISTALERÍA:

Los materiales de cristalería para esterilización se lavan con agua y jabón y después se secan con papel secante.

El material de cristaleria que se va esterilizar debe tener una preparacion previa evitar que se vuelvan a contaminar con posterioridad a su esterilización y mantenerlas en esas condiciones hasta su utilización.

Ø  Vasos de precipitado: se rellenan de algodón o gasa y después se envuelven en papel estraza y se aseguran con cinta adhesiva.

Se colocan los materiales asegurados con cuidado en el autoclave por 20 minutos a una presión de 15 PSI.

Ø  Las pipetas: Se taponean de tal manera que no dificulte la succión, pero al mismo tiempo impida el paso hacia la boca del material que esté pipeteando.

Ø  Placas de Petry: Después de ensambladas (tapa y caja) podrán ser colocadas dentro de un cilíndrico de metal inoxidable con tapa, fabricado específicamente para ese uso, o en su defecto, las placas serán empaquetadas con papel de estraza, individualmente, en parejas o en grupos de no más de 5 placas.

Ø  Tubos de ensayos: Se taponean con algodón y se envuelven con papel de estraza en grupos de 5 a 10 tubos.

Otros

Autoclave: se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado es el de Chamberland. Esteriliza a 120º a una atmósfera de presión (estas condiciones pueden variar) y se deja el material durante 20 a 30 minutos. 

Bibliografía:

http://es.scribd.com/doc/3246492/Material-de-laboratorio

http://www.emagister.com/curso-metodos-esterilizacion-laboratorio-quimico/esterilizacion-calor-humedo

2.2.5. ESTERILIZACION CON CALOR HUMEDO

Calor húmedo

Destruye a los microorganismos por coagulación de las proteínas. La presencia de

agua facilita el proceso de destrucción de los microorganismos.

Vapor a presión (autoclave):

El calor en forma de vapor saturado a presión proporciona temperaturas mayores que la de ebullición. La esterilización en autoclave emplea vapor saturado a  15 lbs. de presión cuya temperatura es de 121ºC, por 15 minutos contados a partir del momento en que el material alcance los 121ºC.

USOS:  Esterilización de  material contaminado, medios de cultivo y líquidos

termoestables.

Limitaciones: No es efectivo en medios impermeables al agua, ni en materiales

sensibles al calor o a la humedad.

Ø  Existen otros métodos que utilizan el calor húmedo, que aunque no permiten la eliminación total de los microorganismos viables, se usan para controlar los microorganismos presentes en un material o una preparación. 

Entre ellos están: 

Tindalización: Es un método de esterilización fraccionada, consiste en calentar el material a la temperatura seleccionada (entre 60º y 100ºC) por períodos aproximados de

30 minutos a 1 hora, por 3 días consecutivos con períodos de incubación intermedios, las formas vegetativas se destruyen por el calentamiento y las esporas germinan durante el período de incubación intermedio y son eliminadas en el siguiente calentamiento.

                     USO: Esterilización de materiales lábiles a más de 100ºC pero estables a temperaturas entre 60 y 100ºC.

                    Limitaciones: Proceso muy largo (3 días). Puede que no se logre la esterilización.

           Agua hirviente: Consiste en poner el contacto el material con agua hirviendo por un periodo no menor a 10 minutos. Se usa para la destrucción de microorganismos patógenos no formadores de esporas en ropas, platos, etc. También se puede emplear en el control de microorganismos presentes en el agua de consumo.

Pasteurización: utilizado en la eliminación de microorganismos patógenos en  productos lácteos, vinos, cerveza y jugos.

Bibliografía: 

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/08_Tema_14_Limpieza__desinfecci%C3%B3n.pdf

2.2.4. FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL PROCESO DE ESTERILIZACION

Factores que Intervienen en el Proceso de Esterilización

La eficacia de un proceso de esterilización depende de cómo se realice el proceso en sí y de múltiples factores relacionados con el objeto: estructura física, nivel de contaminación inicial, de limpieza, compatibilidad con el proceso de esterilización, tipo de envoltorio, etc. Todas las fases de un proceso de esterilización (limpieza, preparación del equipo, esterilización, almacenaje y transporte) deben validarse y controlarse.

Ø  Factores relacionados con el objeto

Los niveles de contaminación del objeto: presencia de materia orgánica y de

Microrganismos Pueden alterar y condicionar el proceso de esterilización y derivar al fracaso del mismo. La presencia de proteínas protege a los microorganismos frente a la acción de los agentes esterilizantes, específicamente los químicos. Con el fin de eliminar la materia orgánica y reducir la carga microbiana (y garantizar con ello la eficacia del proceso de esterilización), el material debe descontaminarse previamente mediante una limpieza exhaustiva. Algunos autores demuestran que después de una limpieza minuciosa de material de difícil acceso contaminado artificialmente (fibroscopios, agujas espinales, catéteres,...) se logra una reducción microbiana de entre un 99.90% y un 99.99%.

Ø  Configuración física del material:

Los avances científicos en el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades han desarrollado una gran diversidad de material crítico con distinta forma, tamaño, complejidad, fragilidad y sensibilidad. En función de su estructura y configuración física se elegirá un determinado procedimiento de esterilización. En el Real Decreto 414/1996 del 1 de Marzo, transposición de la Directiva 1993/42/CEE, se regulan y clasifican los productos sanitarios; en él se especifica la responsabilidad del fabricante de describir las condiciones requeridas para reprocesar el material, sin modificar su funcionalidad y características. El profesional sanitario tiene la responsabilidad de aplicar el proceso de esterilización más adecuado y demostrar que puede reproducirlo exactamente. El proceso de esterilización supone un reto importante para el material con luces o conductos largos o con espacios muertos. Para estos instrumentos será necesaria la aplicación de prácticas específicas.

Ø  Limpieza del material previa a la esterilización:

El proceso de limpieza se define como la aplicación de un procedimiento físico-químico encaminado a eliminar la suciedad y otros materiales ajenos al objeto. La limpieza previa de un objeto es una práctica indispensable para garantizar la efectividad de un proceso de desinfección o esterilización. El agua y los detergentes usados en la limpieza deben reunir unas características determinadas.

Ø  Agua: 

   Es importante verificar la calidad del agua para conseguir la máxima eficacia del detergente. Un agua dura puede disminuir su efectividad. Para evitar la corrosión del instrumental quirúrgico se recomienda la utilización de agua desmineralizada durante el proceso de limpieza o, como mínimo, en el último aclarado. Nunca debe utilizarse suero fisiológico para limpiar y/o aclarar el instrumental porque puede producir corrosión. Es también importante controlar la temperatura del agua, que no ha de ser excesivamente elevada (entre 20ºC y 45ºC); temperaturas altas favorecen la coagulación de la albúmina y dificultan su eliminación.

Ø  Detergente:

     Los detergentes neutros (pH 7) están indicados para la limpieza de instrumental quirúrgico delicado, pero son menos eficaces para la eliminación de sustancias orgánicas. Algunos sistemas automatizados de lavado de instrumental utilizan detergentes ligeramente alcalinos (pH de 8 a 11) que se neutralizan posteriormente en el aclarado. Se ha demostrado que los detergentes enzimáticos son más efectivos que los detergentes alcalinos para la limpieza del material de difícil acceso. Su eficacia está relacionada con el hecho de contener endopeptidasas, enzimas que hidrolizan los enlaces de la molécula proteica y facilitan así la eliminación de contaminantes de base proteica como sangre y secreciones. Cuando se utilice un detergente en polvo hay que tener la precaución de disolverlo previamente, ya que podría obstruir canales o iniciar un proceso de corrosión si alguna partícula quedase incrustada en alguna ranura del instrumental. Deben evitarse los detergentes espumantes porque dificultan el contacto del detergente con el objeto. Los detergentes deben diluirse correctamente según las indicaciones de cada fabricante.

Bibliografía :

http://www.scfarmclin.org/docs/higiene/part6/6.pdf